肥胖大鼠瘦素信號傳導通路的變化

蘇 衛，馬曉紅，張文明，劉紅霞，張連峰

(中國協和醫科大學中國醫學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

研究報告

肥胖大鼠瘦素信號傳導通路的變化

蘇 衛，馬曉紅，張文明，劉紅霞，張連峰

(中國協和醫科大學中國醫學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

目的篩選與人類代謝障礙性肥胖癥發病病因學相似的肥胖大鼠模型，并對肥胖個體Leptin信號傳導通路的改變情況進行初步研究。方法離乳雄性Wistar大鼠以高脂飼料喂養6周后，取體重增加值大的前1/4部分作為肥胖傾向組大鼠。對肥胖傾向組大鼠，繼續進行高脂飼料喂養，并觀察其體重、血清 Leptin的變化趨勢;試驗49周后，大鼠處死，對內臟脂肪含量、附睪脂肪細胞大小以及下丘腦 LRb(Leptin受體 b亞型)表達水平及Stat3磷酸化水平(Tyr705磷酸化)進行測定。結果正常對照組大鼠和肥胖傾向組大鼠在不同飼料喂養的第17周開始體重相對增加值出現組間顯著性差異;除第16周肥胖傾向組大鼠的血清 Leptin濃度高于正常對照組，但不存在顯著性差異之外，其它采血時間點，肥胖傾向組的血清 Leptin濃度均顯著高于正常對照組;動物處死后，肥胖傾向組大鼠的內臟脂肪含量和附睪脂肪細胞大小均顯著大于正常對照組;兩組大鼠在下丘腦LRb表達水平和細胞漿內Stat3磷酸化水平方面不存在顯著性差異。結論本研究得到了與營養性肥胖人群臨床表現相似的肥胖大鼠;同時發現，肥胖大鼠在長期高濃度Leptin刺激后，可能引起了中樞性 Leptin抵抗，致使 Leptin對體重調節的正常生理作用受到抑制，脂代謝異常的程度進一步加深，最終表現為脂肪細胞體積增大、內臟脂肪含量升高和體重增加。

肥胖大鼠;高脂飲食;廋素;信號傳導通道

肥胖是遺傳因素、環境因素和心理因素共同作用所導致的代謝障礙性疾病，肥胖癥的發生，不僅對機體自身產生直接影響，也是諸多代謝性疾病的主要誘因［1］。

本研究選用具有遺傳多態性的封閉群 Wistar大鼠［2］，以高脂飼料作為大鼠能量攝入來源，通過長期的喂養、篩選后，希望能夠得到與人類營養性肥胖癥病因相近，臨床表現相似的肥胖大鼠模型。而瘦素(Leptin)，主要通過白色脂肪細胞分泌，是食物攝入和能量消耗的重要傳入型信號分子，通過作用于中樞神經下丘腦中特定神經元上的瘦素受體(Ob－Rb)激活下游不同的信號通路進行食物攝入和能量消耗的調節［3］。其中在下丘腦核團高度表達的主要功能受體b型(LRb)，為長跨膜受體，屬于細胞因子 I受體超家族，該受體激活后，通過 JAKSTAT(Jak激酶－信號傳導及轉錄激活因子)途徑進行生物信息的傳遞，從而對食物攝入和能量消耗進行調控。故本研究將血清Leptin、下丘腦LRb、Stat3和Tyr705磷酸化的 Stat3作為考察的主要指標，力求在Leptin信息傳導通路方面對肥胖發生的病理學機制進行探索性研究。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

離乳雄性Wistar大鼠(SPF)，中國醫學科學院實驗動物研究所資源中心提供［SCXK(京)2000－0006］。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑:Leptin測定用試劑盒(Assay Designs，900－015);Stat3抗體(兔抗鼠 Stat3，Cell Signaling Technology，#9132);Phospho－Stat3抗體(兔抗 鼠 Phospho－Stat3，CellSignaling Technology，# 9131S)，LRb抗體(兔抗鼠 LRb，Alpha Diagnostic International，OBR13－A);化學發光底物 (Pierce Biotechnology，34077)。

1.2.2 主要儀器:粗纖維測定儀(M6型，Tecato);高溫爐(KM－100型，ASH);索氏脂肪提取裝置;全自動酶標儀(Stat fax2100型，Awareness Technology Inc);高速冷凍離心機(CS－15R型，Bcekman);Nikon顯微鏡;垂直式電泳儀(AE－6450型，ATTO Co.日本);半干式電轉移裝置(AE－6675型，ATTO Co.日本);凝膠圖像成像分析儀(GAS7001B型，UVI，英國);成像軟件:UVIPhoto;分析軟件:UVISoft UVIBand Application V97.04。

1.3 實驗用飼料

特定能量值的維持飼料和高脂飼料由中國醫學科學院實驗動物研究所資源中心提供［SCXK(京) 2001－0003］。

對飼料中碳水化合物、粗脂肪、粗蛋白均采用化學法進行含量測定，具體的操作步驟見GB14924.9－2001。

飼料中各營養素提供能量的計算標準為［4］:炭水化合物提供能量為16.75 kJ/g;蛋白提供能量為16.75 kJ/g;粗脂肪提供能量為37.68 kJ/g，其余成分不提供能量。

1.4 方法

1.4.1 動物分組:離乳雄性 Wistar大鼠進入動物房，適應環境3 d，稱重(W0)后隨機分組，9只/組。在保證動物有充足的食物和飲水的前提下，取其中任一組作為正常對照組，給予維持飼料;其余為高脂飲食組，給予高脂飼料(室溫22℃ ±3℃，相對濕度30%～73%，12 h晝夜光照)。正常對照組大鼠和高脂飲食組大鼠分別喂養6周后，稱重(W1)。正常對照組動物保持不變，將高脂飲食組各大鼠按照體重增加值(W1－W0)的大小進行排隊，取體重增加值大的前1/4部分(即體重增加顯著的9只大鼠)作為肥胖傾向組;其余高脂飲食組大鼠棄去［5］。

1.4.2 觀察指標:體重、血清Leptin水平:實驗過程中每周測定體重一次;Leptin的測定用雙夾心ELISA法。

1.4.3 組織收集和樣本處理:大鼠乙醚麻醉后股動脈取血，離心，收集血清;為進行Western Blot分析，將大鼠處死后，分離下丘腦，稱重，置于0.3 mL蛋白裂解液中(10 mmol/L Tris－HCl，pH6.8;2%SDS;0.08 μg/mL okadaic acid。蛋白酶抑制劑，1 mmol/L PMSF，0.1 mmol/L Benzamidine，和 2 μmol/L leupetin)，以手動組織研磨器研磨。將勻漿迅速煮沸 2 min后，置冰上冷卻，14000 r/min，4℃ 離心15 min。取上清，Brandford法測定總蛋白濃度后分裝凍存于－70℃。

1.4.4 內臟脂肪含量的測定:分別取附睪脂肪墊、腹膜后脂肪墊和腸系膜脂肪墊，稱重，依據下述公式進行計算:內臟脂肪含量%=(附睪脂肪墊重+腹膜后脂肪墊重+腸系膜脂肪墊重)÷體重×100%

1.4.5 附睪脂肪細胞大小的測定:取附睪脂肪墊，用40 g/L甲醛固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色。將固定切片處理過的附睪脂肪墊置于400倍顯微鏡下計數全視野中的脂肪細胞個數，用測微尺測量脂肪細胞的大小。每張切片計數10個視野的細胞數，測量10個細胞的直徑，取平均值作為每例的數據［6］。

1.4.6 LRb分析:取蛋白提取液(160 μg)于SDSPAGE凝膠分離，電轉移至硝酸纖維素膜，將膜與特異的抗LRb抗體孵育，通過增強酶聯化學發光法和灰度掃描來定量。

1.4.7 Stat3和 phospho－Stat3分析:取蛋白提取液(60 μg)于SDS－PAGE凝膠分離，電轉移至硝酸纖維素膜，將膜與特異的抗Stat3抗體(磷酸化和非磷酸化)和Tyr705磷酸化的Stat3抗體孵育，通過增強酶聯化學發光法和灰度掃描來定量。

2 結果

2.1 維持飼料和高脂飼料營養素

組別/項目Group/Item 脂肪Fat 蛋白質Protein 碳水化合物Carbohydrate維持飼料Control dietary(1298 kJ/100g)質量組成(%)Mass components 3.17 17.40 52.99能量組成(%)Energy components 9.20 22.45 68.35高脂飼料High－fat dietary(1628 kJ/100g)質量組成(%)Mass components 18.99 14.51 40.00能量組成(%)Energy components 43.95 14.92 41.14

表2 大鼠體重變化Tab.2 Changes of body weight

經化學分析，實驗所使用的維持飼料和高脂飼料中的各種營養素的質量組成和能量組成如表1。

2.2 大鼠體重的變化

通過1年對肥胖傾向組與正常對照組大鼠體重的動態觀察，發現高脂飼料喂養的大鼠在第14周開始，體重絕對增加值較正常對照組出現顯著性的增加，第17周開始體重相對增加值出現顯著性增加，從而表明，本研究所采用的肥胖傾向大鼠篩選方案是可行的(表2)。

2.3 血清Leptin的變化

對血清Leptin進行測定的結果表明，除第16周肥胖傾向組大鼠的血清 Leptin濃度高于正常對照組，但不存在顯著性差異之外，其它肥胖傾向組的血清Leptin濃度均顯著高于正常對照組(表3)。肥胖傾向組大鼠在Leptin水平長期高于正常對照組大鼠的情況下仍然表現為顯著性的體重增加，這說明，肥胖傾向組大鼠可能發生了Leptin抵抗。

2.4 脂肪組織與細胞的變化

正常對照組大鼠和肥胖組大鼠處死后，取附睪脂肪墊進行 HE染色，于400倍鏡下觀察形態學變化(圖1，見彩插2)。通過對正常對照組大鼠和肥胖組大鼠內臟脂肪重量、顯微鏡下相同視野內脂肪細胞的記數進行統計，肥胖大鼠的脂肪細胞直徑、內臟脂肪重量及內臟脂肪含量(%)都顯著高于正常對照組(表4)。對所有18只大鼠(包括正常對照組和肥胖組各9只)的內臟脂肪重量和Leptin濃度之間的相關性進行分析(圖2)表明，二者之間呈正的直線相關關系，這表明，內臟脂肪含量對血清Leptin濃度的增加發揮了直接作用。

2.5 下丘腦Leptin受體b亞型(LRb)蛋白表達量及胞內Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平

用Western Blot測定下丘腦 Leptin受體 b亞型(LRb)蛋白表達量(圖3A)和胞內Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平(圖3B)，結果均未出現顯著性差異。

表3 血清Leptin的測定結果Tab.3 Changes of serum Leptin concentration

表4 大鼠脂肪組織、細胞指標Tab.4 Changes of rats adipose tissue and adipocytes

3 討論

肥胖，不僅僅是體重增加，血脂異常。隨著包括高血壓、糖尿病和心臟病等代謝性疾病與肥胖密切關聯的不斷明晰，對肥胖，特別是代謝障礙性肥胖的研究已提升到一個新的高度。肥胖的形成，與生活行為方式、攝食行為、嗜好、胰島素反應以及社會心理因素相互作用有著密切的關系，而多基因的遺傳因素則是其致病的本質因素。在對基因剔除小鼠的研究中就發現，有超過6000個基因可能影響小鼠的體重［7］。眾多的基因，在環境因素，特別是食物營養結構和能量供給發生極大變化(高糖、高脂肪飲食)的情況下，使機體正常的食物神經調節網絡［8］，脂肪因子調節［9］和能量平衡系統［10］的相互調節作用發生紊亂，致使機體能量平衡失調，從而導致肥胖。

圖2 內臟脂肪重量與血清Leptin濃度間的相關性分析Fig.2 Correlativity between weight of visceral fat and concentration of serum Leptin

圖3 高脂飲食對LRb蛋白表達量和Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of the high－fat diet on protein expression of Leptin receptor b(LRb)and phosphorylation extent of Stat3 at the location of tyr705

本研究利用封閉群 Wistar大鼠的遺傳多態性，篩選出具有肥胖傾向的大鼠，并以此為實驗對象，結合長期給與高脂飼料喂養，可使攜帶肥胖傾向基因的動物最終發展為與人類代謝障礙性肥胖癥病因相近，臨床表現相似的肥胖大鼠模型。其中，肥胖組大鼠與正常對照組比較，脂肪細胞體積顯著增大;內臟脂肪重和體脂含量也顯著高于正常對照組大鼠。證明，具有肥胖傾向的大鼠經長期高脂飼料喂養后，會引起大鼠體內脂肪細胞不斷增大，細胞內膽固醇合成增加［11］，從而導致脂肪進行性堆積，體重持續性增加。

而瘦素(Leptin)，這種主要由白色脂肪分泌的肽類物質，其受體激活后，通過JAK－STAT途徑來進行生物信息的傳遞，從而對食物的攝入及能量的消耗做出調控。Western Blot的結果表明:盡管肥胖傾向組大鼠血清 Leptin濃度顯著高于正常對照組大鼠，但是兩組大鼠在下丘腦LRb蛋白的表達水平上以及由Leptin和 LRb特異性結合后所引起的胞漿內Stat3磷酸化水平方面均不存在統計學差異。這與Shu等［12］對雄性 C57Bl/6J小鼠進行19周高脂喂養研究、Sahu等［13］對雄性Wistar大鼠進行9周高脂喂養研究和 Christian等［14］對雄性 Wistar大鼠進行15周高脂喂養研究后所得到的結果基本一致。通過對上述實驗結果進行分析，我們認為:大鼠在長期的高脂飼料喂養過程中，隨著血清 Leptin濃度的進行性增加，產生了由持續性高 Leptin濃度刺激所引起的LRb對Leptin作用的進行性脫敏效應，最終導致中樞性 Leptin抵抗。也就是高脂飼料喂養后，大鼠體內能量平衡狀態和脂代謝發生異常時，Leptin對食欲、能量消耗及交感神經活性的正常調控作用受到抑制，從而出現了，即使大鼠血清Leptin水平持續增高，仍然表現為進行性的體重增加和體脂含量增加的現象。

此外，將分離得到的脂肪總重量和血清 Leptin水平二者間進行相關性分析發現，全脂肪重量和血清Leptin水平間呈正的直線相關關系(r=0.7791)，這與文獻報道中“Leptin主要由白色脂肪細胞分泌的”這一結論相吻合。

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Changes of Leptin Signal Pathway in Rat Obesity Progression

SU Wei，MA Xiao－hong，ZHANG Wen－ming，LIU Hong－xia，ZHANG Lian－feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo screen obesity rat model of metabolic disturbance，and to determine whether Leptin signal transduction pathway in obesity rats are changed or not.Method Male Wistar weaning rats were divided randomly into control group and high－fat fed group.Rats of high－fat fed group were fed high－fat diet for 6 weeks，and then，screened them based on body weight gain(upper quarter for obesity－prone rats).During the dietary period，body weight and serum Leptin level of obesity－prone group rats and control group rats were determined on schedule;Rats were decapitated 12 months later，content of body lipid，size of epididymis fat cell and protein expression level of LRb，Stat3 and p－Stat3 in hypothalamus were determined as well.Result Both body weight and relative added body weight had got significant differences between control group and obesity－susceptible group after the 17thweek feeding;serum Leptin level had significant differences between control group and obesity－susceptible group except for the 16thweek;Percent of body lipidsand the size of epididymis fat cell had got significant differences between control group and obesity－susceptible group after the special diet feeding for 49 weeks;LRb protein expression level and Stat3 phosphorylation level in hypothalamus had no differences between obesity－susceptible group and control group。ConclusionOur study got the first generation of obesity rat model which had the similarly pathogenesis and clinical symptoms successfully.The down－regulation of LRb must be a key factor charged for the disregulation of lipid metabolism.

Obesity rat;High－fat feed;Leptin;Signal pathway

Q495

A

1671－7856(2010)05－0015－06

2009－10－15

衛生部行業基金，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

蘇衛(1962－)，女，副研究員，研究方向:代謝性疾病比較醫學。

張連峰。E－mail:Zhanglf@cnilas.org