黃渤海松江鱸魚線粒體控制區結構與序列多態性分析

劉海林，章群，唐優良，余帆洋，周佳怡

（暨南大學水生生物研究所，廣東省水體富營養化與赤潮防治重點實驗室，廣東 廣州，510632）

黃渤海松江鱸魚線粒體控制區結構與序列多態性分析

劉海林，章群，唐優良，余帆洋，周佳怡

（暨南大學水生生物研究所，廣東省水體富營養化與赤潮防治重點實驗室，廣東 廣州，510632）

測定了遼寧丹東、盤錦與河北秦皇島35尾松江鱸魚線粒體控制區序列977 bp。共檢出單倍型30個，多態位點35個，簡約信息位點27個，絕大多數變異集中在192-342 bp、594-783 bp區段，同時識別出了線粒體控制區5’端終止序列區、中央保守區和3’端保守序列區的關鍵序列。3個群體總的單倍型多樣性為0.990，核苷酸多樣性為0.007 18，丹東群體核苷酸多樣性最高（0.009 59）。群體間、群體內平均遺傳距離低（分別為0.006 7和0.006 3）；在NJ樹上不同地理來源的個體混雜分布；Fst分析顯示丹東與秦皇島群體間遺傳分化相對較大（0.142 22, p＜0.05），其余不明顯（0.028 65-0.056 16, p＞0.1），表明3個群體有可能隸屬同一個種群。核苷酸不配對分布圖表明松江鱸魚可能未經歷過大規模的種群擴張。

松江鱸魚；黃渤海群體；線粒體控制區結構；遺傳多樣性

松江鱸魚(Trachidermus fasciatus Heckel)隸屬鲉形目(Scorpaeniformes)杜父魚科(Cottidae)的松江鱸魚屬(Trachidermus)，俗名“四鰓鱸”、“花鼓魚”等，是東亞暖溫帶沿海的一種降河洄游性魚類[1]。主要分布在中國東部、日本南部、朝鮮西南及菲律賓等沿海地區，居中國“四大淡水名魚”之首，具有較高的營養價值和經濟價值[2]。但近年來，由于環境污染、氣候變化、江河沿海水利設施修建對魚類洄游通道的阻斷以及誤捕濫捕等原因，松江鱸魚種群數量急劇下降，在一些原有分布記錄的水域已難覓其蹤跡，現已被列為國家二級保護動物。因此，對于松江鱸魚種質資源的管理保護和開發利用工作顯得尤為重要和緊迫[3,4]。

目前對松江鱸魚的報道多集中在資源調查與保護、繁育及生理生態等方面[3,5-8]，遺傳多樣性的研究相對較少，而遺傳多樣性的高低是評判物種對環境的適存能力和進化潛力的依據，了解物種遺傳多樣性是種質資源保護和開發利用的基礎[9]。王金秋等（2002）研究了鴨綠江流域松江鱸魚同工酶的遺傳變異[10]。徐建榮等（2008, 2009）開展了丹東和秦皇島松江鱸魚遺傳多樣性的AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）和ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)分析[11,12]。非編碼的線粒體控制區（mitochondrial D-Loop）受選擇壓力較小，進化速率比編碼的核基因快，含有更為豐富的遺傳變異信息；作為核基因分子標記的有效補充，已廣泛應用于種群鑒定、遺傳多樣性、系統地理學等研究領域[13-15]。目前關于松江鱸魚線粒體控制區基因的研究報道鮮見，本研究測定了丹東、盤錦、秦皇島3個松江鱸魚地理群體的線粒體控制區基因序列并對其進行結構分析,探討松江鱸魚種群的遺傳結構、遺傳多樣性和種群動態等,以期為松江鱸魚相關研究工作的開展提供參考。

圖1 采樣地點及洋流Fig. 1 Sampling locations and ocean currents

1 材料和方法

1.1 樣品采集、DNA提取及PCR擴增

采集到松江鱸魚共35尾,體長50.6-149.1mm，平均為91.78 mm，標準差28.05，其中遼寧丹東15尾(編號:DD1-15)，盤錦6尾(編號:PJ1-6)，河北秦皇島14尾(編號:QHD1-14)。所有樣品肌肉用95%乙醇保存，采樣地點見圖1。DNA的提取及PCR擴增參考陳藝燕等(2006)[16]。PCR擴增引物為CrF：5′-tcggtcttgtaatccgaagatcggaggtt-3’和CrR： 5’-agtcaggaccaagcctttgtgc-3’。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至北京六合華大基因公司進行測序，測序引物與PCR擴增引物相同。

1.2 序列測定及數據處理

序列經人工校對后，利用ClustaX1.83作序列比對。MEGA4.0軟件分析序列堿基組成、遺傳距離及序列相似性。以Genbank下載的西刺杜父魚Cottus Kazika(登錄號:AB188157)為外類群，利用MEGA4.0 的Kimura 2-parameter模型構建鄰接(Neighbor-Joining, NJ)樹。進化樹評估采用Bootstrap 1000次重復抽樣檢驗。DnaSP5.10軟件分析群體單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多態性(π)，并作Tajima’s、Fu & Li’s檢驗計算群體間Fst、Nm值。TCS1.21軟件分析單倍型分布情況。Arlequin3.11軟件作核苷酸不配對分布和AMOVA分析。

2 結果與分析

2.1 松江鱸魚D-Loop序列特征

松江鱸魚D-Loop序列比對長度為977bp，其中保守位點941個，多態位點35個（占3.58%），簡約信息位點27個，符合線粒體控制區序列變異大的特點。多數變異位點集中在192-342 bp、594-783 bp區段內；丹東DD5、8、10、12、13在742bp處插入一個堿基T，DD1、2、6、11、14在747-755位置缺失9個堿基，其余序列均無上述插入與缺失情況。序列T、C、A、G平均含量為29.7%、21.8%、30.9%、17.6%；（A+T）%＞（G+C）%。序列存在轉換、顛換、插入和缺失4種類型，轉換數5，顛換數3，轉換/顛換比為1.8。

線粒體控制區序列可分為5’端終止序列區(terminal associated sequences,TAS)、中央保守區(central conserved sequence block)、3’端保守序列區(conserved sequence block)。其中中央保守區可依次分為CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-B、CSB-C區，3’端保守序列區可分為CSB1、CSB2、CSB3區[17]。在圖2中，松江鱸魚線粒體控制區5’端TAS普遍形式 為(---表示發生轉換、顛換或缺失的堿基；……表示序列省略；下劃線表示相似關鍵序列；下同)，其中TACAT與ATGTA互為反向互補序列，可形成發夾結構，與鯉科魚類TAS關鍵序列相似[18,19],但在前半段出現了一對位置交換的TACAT…ATGTA互補序列重復。中央保守區CSB-F普遍形式為ATGT T……ACCAGCTAGAACCTCATT……ACCAT……AGAACC，鯉科(ATGTAG----GAGACCACC)、鲿科魚類(ATGTAGTAAGA-ACCA-CAACC)略有不同[18-20]。CSB-E普遍形式為TGAGGGACAAGT-ATT CGTGGGGGT，與鲿科魚類結構相似[20]。CSB-D普遍形式為TATTCTTA……AAT(T/C)TGTA，與鯉科魚類相似[18,19]。CSB1普遍形式為TGATTTATT ACTCGAAACT……ATTTACCCCCC,與鳑鲏CSB1(TT-ATTATTGAA-GAC ATA，其后有1個TATGCCCCC序列)結構相近，并未發現較為保守的GACATA序列,但在CSB1之后發現有1個多C堿基的TTTACCCCCC序列[18]。CSB2 和CSB3的普遍形式為TAAACCCCCCTACCCCCCTAAA和CTGTAAACCCCCCGGAAACA G，與鳑鲏、大口胭脂魚、雅羅魚、溪鳉、鲿科、沙鰍亞科等魚類相似[18-24]，但與溪鳉CSB3(CATTACAAACT-TAAACCA) 略有不同[23]。

圖2 松江鱸魚線粒體控制區各部分序列結構Fig. 2 Structure of D-Loop sequence of Trachidermus fasciatus

2.2 系統發育和遺傳分化

松江鱸魚地理群體內遺傳距離分別為:丹東0-0.016；盤錦0.001-0.008；秦皇島0-0.009，其中丹東DD2與DD6、秦皇島QHD12與QHD14間遺傳距離均為0。群體間的遺傳距離范圍為0.005-0.008，平均值為0.006 7，小于花鱸群體間的平均遺傳距離(0.008)和鱭屬群體間平均遺傳距離(0.017-0.098)[25,26]。不同地理來源的個體PJ1與QHD2及PJ3、QHD13與DD13間遺傳距離均為0。在以西刺杜父魚AB188157為外類群構建的NJ系統樹中，丹東、盤錦、秦皇島群體均未單獨聚類；雖然少數同一地理來源的個體聚在同一分支內，但節點的支持率并不高；不同地理來源的個體大部分混雜在一起，未發現明顯的地理結構（圖3）。

在表1中，盤錦與丹東、秦皇島群體間的Fst值遠低于丹東與秦皇島群體間Fst值，丹東與秦皇島群體間遺傳分化程度相對大些。丹東與秦皇島群體間1＜Nm＜4,表現出一定程度的基因交流；丹東、秦皇島與盤錦群體間Nm值均大于4，基因交流頻繁。AMOVA分析結果顯示，群體間遺傳變異約占17.034 82%，遺傳變異主要來自群體內部。

圖3 基于線粒體控制區基因序列的NJ系統樹Fig. 3 NJ tree based on D-Loop sequences of Trachidermus fasciatus

表1 群體間遺傳分化指數 (Fst) 和基因流 (Nm)Tab. 1 Genetic differentiation index (Fst) and gene flow (Nm) between populations

2.3 遺傳多樣性和種群動態

35 尾松江鱸魚共檢出30個單倍型(haplotype)(表2)。TCS1.21分析單倍型分布情況顯示，DD2與DD6、QHD12與QHD14、PJ1與QHD2分別共享同一單倍型；PJ3、QHD13與DD13共享同一單倍型，其余每個個體獨享一種單倍型。各群體的單倍型多樣性(Hd)維持在一個較高水平(0.989-1.000)：盤錦＞丹東＞秦皇島。核苷酸多樣性 (π)丹東＞盤錦＞秦皇島。總體顯現單倍型多樣性高(0.990)而核苷酸多樣性低(0.007 18)。各群體和整體的Tajima’s D均為負值且未達顯著水平(P ＞0.1)。Fu&Li′s檢驗亦為負值，未達顯著水平(P ＞0.1)，表明我國黃渤海松江鱸魚可能未經歷種群快速擴張。核苷酸不配對分布呈不規則的多峰曲線，不符合種群擴張的單峰曲線模式，也說明松江鱸魚可能未經歷大規模的種群擴張過程(圖4)。

圖4 松江鱸魚D-Loop序列核苷酸不配對分布圖Fig. 4 Mismatch distribution for the D-Loop sequences

表2 基于松江鱸魚線粒體D-Loop序列的群體遺傳變異Tab. 2 Genetic variation based on mitochondrial D-Loop sequences in Trachidermus fasciatus populations

3 討 論

3.1 松江鱸魚種群遺傳多樣性分析

松江鱸魚3個地理群體表現單倍型多樣性高(0.989-1.000)而核苷酸多樣性低(0.004 51-0.009 59)的特點，這種現象在鳀魚(Engraulis japonicus)、鳳鱭(Coilia mystus)、鰳魚(Ilisha elongata)等多種魚類中也存在[27-29]。這可能與松江鱸魚種群起源較晚有關，在一個較短的歷史時期內，群體內部因少量的堿基突變即可使單倍型多樣性得到快速積累,而對于核苷酸多樣性的累積貢獻卻不明顯[14]。

盤錦、秦皇島群體遺傳多樣性低而丹東群體遺傳多樣性相對較高，可能有歷史和現實兩方面的原因：在第三紀至晚更新世時期，大規模的造山運動和火山活動，使原渤海區域基底構造變化,導致整體下沉，引發海侵。此后多次大范圍的海侵和洋面的回升使渤海海面進一步擴大,冀魯平原與下遼河平原也隨之分離開[30]。可能在此時期，生活在鴨綠江水域及鄰近水域（遼東半島東海岸、海侵前的黃渤海交界處的原海岸區域及山東半島東北海岸區）、在遺傳多樣性和親緣上較近的松江鱸魚原始種群中的一部分隨著海侵過程或者沿岸流遷入渤海，在不同的河口海岸棲息并繁衍至今，逐漸形成了新的地理群體，如盤錦和秦皇島群體，在經歷過了奠基者效應之后，遺傳多樣性有所降低。而未發生遷移的其它原始群體繼續留棲生活在鴨綠江及鄰近水域，如丹東群體，由于未經歷過瓶頸效應或受影響較小，故而遺傳多樣性相對高些[31]；盤錦、秦皇島群體遺傳多樣性低的現實原因可能與環渤海經濟圈建設造成的水環境污染及產卵場地的破壞等原因致使種群數量銳減有關；而丹東群體遺傳多樣性較高可能與鴨綠江沿岸及河口附近污染源較少、當地漁民無捕食該魚的習慣、市場需求少等有關，此外,在松江鱸魚降海洄游和產卵時期天氣已冷,漁業捕撈基本停止,無意中也保護了有限的種群資源[10]。

3.2 種群遺傳分化分析

王金秋等(2008)從形態角度對遼寧、山東、浙江3個松江鱸魚群體分析指出群體間存在向亞種分化的趨勢[32]。王金秋等(2002)對鴨綠江松江鱸魚種群的同工酶分析以及徐建榮等(2008, 2009)對丹東和秦皇島松江鱸魚群體的AFLP和ISSR分析，均得出種群內的遺傳差異小，遺傳分化不明顯的結論[10-12]。本研究以松江鱸魚線粒體基因的控制區序列作為分子標記，對不同群體進行遺傳分析。Fst值顯示，丹東與秦皇島群體間基因交流最少，遺傳分化相對較大；丹東和盤錦間基因交流和遺傳分化程度居中，盤錦與秦皇島群體間基因交流最頻繁，遺傳分化最小。這可能與黃渤海海域間連通、季節性海洋沿岸流傳播頻繁、地理位置又比較接近、松江鱸魚在產卵期和幼年期近海岸短暫生活的習性等因素有關，使得不同地理群體間混雜和基因交流的機會增加，遺傳分化程度降低[2,30,33]。此外，還可能與松江鱸魚種群的歷史分化時期較短等原因有關。AMOVA分析結果也顯示3個群體間遺傳分化不明顯，遺傳變異主要來自群體內部(82.965 18%)，與徐建榮等 (2008，2009)研究的結論一致[11,12]。

3個松江鱸魚群體間遺傳差異較小，在NJ樹顯示各地理群體混雜分布，未表現一定的地理結構；群體間遺傳分化不明顯，彼此間基因交流頻繁；核苷酸不配對分布顯示種群未經歷過大規模的迅速擴張；推測這3個群體可能屬于同一個種群。但由于采樣范圍和數量的局限，上述推測并不排除中國近海松江鱸魚存在著不同地理種群的可能性,對松江鱸魚種群間遺傳分化、遺傳多樣性、種群動態等研究仍有待深入。

3.3 松江鱸魚管理保護措施

松江鱸魚種群遺傳多樣性已處在較低的水平，種群的生存與繁衍正遭受著生態環境的破壞等威脅。鑒于丹東群體的遺傳多樣性相對較高，建議將丹東群體作為優先保護群體，建立種質資源保護區，并通過人工引種和放流來擴大盤錦和秦皇島群體的遺傳變異和數量。同時，加強對松江鱸魚繁殖棲息地的管理，增強群眾的保護意識，減少環境污染，進而實現松江鱸魚種質資源的快速恢復和合理開發利用。

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Structure and genetic diversity of mtDNA D-Loop sequences among Trachidermus fasciatus stocks in Yellow Sea and Bohai Sea of China

LIU Hai-lin, ZHANG Qun, TANG You-liang, YU Fan-yang, ZHOU Jia-yi
(Institute of Hydrobiology, Jinan University; Key Laboratory for Water Eutrophication and Red-tide Control in Guangdong Province,Guangzhou 510632 , China)

977 bp mtDNA control region sequences of 35 individuals of Trachidermus fasciatus from Dandong, Panjin in Liaoning Province and Qinhuangdao in Hebei Province were surveyed，of which 35 polymorphic loci and 27 parsimony-informative sites were found in 30 haplotypes. The majority of variation was concentrated in two segments(192-342 bp, 594-783 bp). Key sequence characteristics of the central conserved region, 5’-termination region and 3’-conserved region of the mitochondrial control region were determined. The total haplotype diversity and nucleotide diversity in 3 stocks were 0.990 and 0.007 18 respectively, of which the Dandong stock had the highest nucleotide diversity (0.009 59). The average genetic distances within and among stocks were both low (0.006 7, 0.006 3),excepting the Dandong stock (0-0.016). Individuals from different sampling localities were intertwined in the NJ tree;Fst analyses revealed that certain gene flow existed among stocks, and genetic differentiation was significant between Dandong stock and Qinhuangdao stock, but that was inconspicuous in the rest stocks, indicating that the 3 stocks might belong to the same population. The mismatch distribution of the control region sequences suggested that Trachidermus fasciatus in the Yellow sea and Bohai sea might not have experienced a large-scale expansion.

Trachidermus fasciatus; stocks of Yellow Sea and Bohai Sea; mitochondrial control region structure;genetic diversity

Q244; Q959.483

A

1001-6932(2010)03-0283-06

2009-11-20 ；

2010-02-01

國家自然科學基金(30770415、40106014)；留學歸國人員科研啟動基金(2005)資助項目

劉海林(1980－)，男，山東濱州人，碩士，主要研究方向：分子生態學。電子郵箱：liuhailin2006@163.com

章群，電子郵箱：tqzhang@jnu.edu.cn