環介導等溫擴增技術在轉基因飼料成分檢測中的應用

內蒙古農業大學動物科學學院 田 芳

農業部飼料生物技術重點實驗室

中國農業科學院飼料研究所基因工程研究室 王秀敏 滕 達 楊雅麟 敖長金 王建華＊

目前全球種植面積最廣泛的商業化轉基因作物為大豆、玉米、棉花和油菜，2009年全球轉基因農作物播種面積達3.3億英畝。在美國，約91%大豆作物、85%玉米作物均為轉基因品種（Clive James，2009），60% ～70%飼料原料由轉基因作物及其副產品組成（OECD，2003）。2009年，美國向中國出口的3130萬噸大豆幾乎全部為轉基因產品，隨著轉基因作物在飼料領域的廣泛應用，研究新的轉基因成分檢測方法對我國飼料行業的科學監管、建立轉基因產品標識制度、轉基因安全評價以及國內外貿易都有重要意義。環介導等溫擴增 技 術 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等（2000）建立的一種新型恒溫核酸擴增方法，利用自動循環的鏈置換反應，在等溫條件下，不到1 h就能擴增出109個靶序列拷貝。該方法不需PCR儀和昂貴試劑，產物可肉眼觀察（肖斌等，2005），已廣泛應用于人畜細菌、病毒等病原體診斷、動物胚胎性別鑒定和轉基因食品檢測等領域 （Zablon等，2010）。 本文在綜述LAMP技術原理和特點的基礎上，展望了其在飼料檢測中的應用前景。

1 LAMP技術原理和特點

1.1 LAMP的原理 等溫擴增反應是針對靶序列上6個獨立區域 （3′端的F3c、F2c和F1c區以及5′端B1、B2和B3區）設計4種特異引物，包括兩對特殊內引物 （FIP由F1c和F2組成，F2與靶序列 3′端 F2c區互補，F1c區與靶序列 5′端 F1c區序列相同；BIP由B1c和B2組成，B2與靶序列3′端的B2c區互補，B1c區與靶序列 5′端的 B1c區序列相同）和外引物（F3，與靶序列的F3c區互補；B3，與靶序列的B3c區互補），利用一種高活性鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（60～65℃）保溫1 h，即可完成靶基因的高效擴增，直接靠擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度或熒光染料染色后的顏色變化來判斷反應結果（Parida等，2006），4條引物與 6個區域的配對確保了該反應的較高特異性 （Fukuta等，2004）。LAMP反應包括啞鈴狀模板合成階段、循環擴增階段、伸長和再循環階段（Notomi等，2000）。反應起始階段，內引物BIP的B2序列與模板的B2c區結合，在Bst聚合酶作用下延伸復制一條新鏈，隨后外引物B3與模板的B3c區結合，一邊延伸形成互補鏈，一邊置換出內引物BIP合成的DNA鏈，最終B3引物形成的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈，而最初BIP合成的DNA鏈以單鏈形式被置換出來，其5′末端B1c與該鏈B1互補配對形成環狀結構。同時內引物FIP以該單鏈為模板與之結合形成互補鏈，此時環狀結構被打開，接著F3引導合成BIP引物合成鏈的互補鏈，置換出FIP引物合成的鏈，該鏈5′末端進行堿基互補配對形成環狀結構，以3′末端B1區為起點，自身為模板進行DNA合成延伸，形成啞鈴狀結構，此為LAMP循環擴增反應起始物。在循環擴增階段，以莖環結構為模板，BIP引物B2與啞鈴結構上B2c雜交結合，開始新一輪鏈置換合成，同時從環狀結構3′端F1區為起點進行DNA合成延伸，同樣置換出的單鏈也會形成環狀結構，以3′末端的F1區為起點，自身為模板進行DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的兩條新莖環結構的DNA，FIP引物與其F2c區結合，開始新一輪的擴增，產物長度增1倍。如此反復循環，形成由不同長度和不同個數花椰菜形狀的莖-環結構的DNA組成的混合擴增產物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列，電泳圖譜為不同大小區帶組成的階梯式條帶狀。

1.2 LAMP的特點 （1）易操作，速度快。LAMP是等溫擴增反應，無需昂貴儀器，水浴鍋即可，適于醫療機構和檢測部門。因無熱變性反應可在1 h內完成，若添加環狀引物則可在30 min內檢測到擴增產物，且產物可用肉眼觀察或濁度儀檢測。若加入逆轉錄酶，則能實現RNA一步擴增。（2）靈敏度高，特異性強。由于4條引物必須與靶序列上的6個區域完全匹配才能保證擴增反應進行，因此特異性強。在病毒檢測中，擴增模板可達1～10個拷貝，靈敏度極高。有研究表明，LAMP比PCR法更具有選擇性和擴增效率，DNA產量可達500 μg/mL （Seki等，2005）。 （3）引物設計方便登陸LAMP技術在線引物設計網站http：//primerexplorer.jp/e/，只需導入靶序列即可自動生成優化引物，同時遵循引物設計的一般原則。（4）局限性靶序列長度最好控制在300 bp以下，大于500 bp則較難擴增。引物設計是LAMP技術的關鍵，設計不當即會出現假陽性或假陰性，出現非特異性擴增且不易鑒別。由于靈敏度高，操作時要嚴謹，避免污染。

2 LAMP技術的改進及其在轉基因飼料成分檢測中的應用

2.1 LAMP的技術改進 雖然LAMP方法比PCR反應速度快，但是與臨床常用的免疫層析等免疫學技術相比，所需時間還是較長，為了滿足臨床需要，人們從各方面改進并完善LAMP技術。Nagamine 等（2002）研究表明，通過在 F2、F1 之間和B2、Bl之間增加2條環狀引物可將LAMP所需的反應時間縮短近一半。同樣，Yano等（2007）在對腸毒素大腸桿菌的檢測研究中，通過加入環狀引物的方式使擴增時間從60 min縮至35 min。由于LAMP反應產物可通過凝膠電泳、產物染色和反應產物是否渾濁來檢測，Maeda等 （2006）在對牙齦卟啉單胞菌的檢測中發現，瓊脂糖電泳和SYRB Green I的檢測極限相近，直接沉淀觀測法則低10倍。LAMP與其他技術聯合使用使得檢測結果更為有效。申建維等（2006）研究表明，將核酸雜交和LAMP技術相結合，建立了多重分子信標LAMP快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法，在反應中兩種不同熒光探針分別與mec A和fem A基因的擴增產物互補序列結合，最后檢測反應管中的兩種熒光值。結果顯示此方法的最低檢測限為10 CFU/mL，與藥敏實驗結果比較，靈敏度99.0%，特異度90.9%，證明該方法靈敏度高、特異性強、操作簡便快速，適用于臨床樣品的直接快速基因檢測。

2.2 LAMP在轉基因飼料成分檢測中的應用目前，LAMP技術已逐漸運用到轉基因作物及其成分的檢測研究上，如對轉基因大豆的檢測。Shiro等 （2004）建立了針對CaMV-35啟動子的LAMP檢測方法，可在轉基因大豆及其產品中檢測到含量為0.5%～5%的轉基因成分。由于95%轉基因植物產品含35 S啟動子，故該法可初檢轉基因成分。蘭青闊等（2008）研究了檢測轉基因抗草甘膦大豆的LAMP技術，針對CP4-epsps合成酶基因的6個區域設計4條特異性引物，建立了針對轉基因大豆CP4-epsps基因的LAMP檢測方法，熒光顯色結果表明該方法能特異性檢測外源基因，靈敏度是常規定性PCR方法的10倍，具有高度的特異性及穩定性，適合轉基因抗草甘膦大豆的快速檢測。劉彩霞等(2009)優化LAMP反應條件，快速、靈敏、有效地檢測轉基因大豆及加工品中整合的EPSPS基因，檢測下限為0.01%，低于國際現行最低檢測量0.5%的要求，可對抗草甘膦轉基因大豆及加工品進行定性檢測。Lee等（2009）對轉基因油菜的煙草花葉病毒35 S啟動子，胭脂堿合成酶基因啟動子和終止子進行LAMP檢測，可從單拷貝模板中檢測到轉基因成分，檢測限也為0.01%，表明該方法適于多種轉基因植物產品的檢測。

3 小結

綜上所述，LAMP技術在簡便性、快速性和敏感性方面均具優勢，可用于飼料中轉基因成分檢測，但由于飼料成分復雜，提取高純度的DNA難度加大，而各種飼料加工工藝又使DNA片段在高溫高壓下可能發生降解，且溫度越高，加熱時間越長，降解越明顯（Patrizia等，2009），這些對外源基因產生的影響，都會延長檢測周期，影響檢測結果。因此針對外源基因在飼料加工過程中的變化和多種成分的干擾，優化完善檢測技術參數，將有利于推動LAMP在轉基因飼料快速檢測中的應用。這對于建立轉基因產品標識制度，完善轉基因產品使用、動態監控和積累基礎數據都具有重要意義。

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