HPLC-MS/MS聯用技術定量測定人血漿中恩替卡韋

郝光濤,李媛媛,何世學,陳 剛,高洪志,劉澤源

(1.軍事醫學科學院附屬醫院藥理室,北京 100071;2.哈勵遜國際和平醫院,河北衡水 053000)

HPLC-MS/MS聯用技術定量測定人血漿中恩替卡韋

郝光濤1,李媛媛1,何世學2,陳 剛1,高洪志1,劉澤源1

(1.軍事醫學科學院附屬醫院藥理室,北京 100071;2.哈勵遜國際和平醫院,河北衡水 053000)

建立HPLC-MS/MS聯用方法定量測定人血漿中恩替卡韋濃度。以地西泮為內標,甲醇為有機相,甲醇-水為(5 mmol·L-1碳酸氫銨)梯度洗脫流動相,Waters-Eterra MS-C18(2.1×50 mm×5μm)色譜柱為分析柱,通過電噴霧離子源(ESI),以正離子多反應監測(MRM)方式檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z278.2→152.1(恩替卡韋)和 m/z285.0→193.0(地西泮,內標)。恩替卡韋的線性范圍為0.05～20 μg·L-1,定量下限為0.05μg·L-1(n=6)。日內、日間精密度的RSD<15%,平均回收率>75%。

恩替卡韋;高效液湘色譜-串聯質譜;血漿藥物濃度

恩替卡韋具有很強的抗 HBV作用,對HBV、DNA復制的起始,逆轉病和DNA正鏈合成等3個階段均起到抑制作用。恩替卡韋的作用靶點是HBV的DNA聚合酶和反轉病酶,通過抑制這些酶,從而抑制前基因RNA逆轉病復制HBV的DNA負鏈,進而抑制正鏈的合成,阻斷HBV的DNA鏈的延伸和裝配。恩替卡韋經口服吸收進入肝細胞后,通過磷酸化作用形成單磷酸脂、二磷酸脂、三磷酸脂,它們(尤其恩替卡韋三磷酸脂)是恩替卡韋在肝細胞內抑制HBV的DNA聚合酶的活性形式。恩替卡韋比其他核苷類似物(如拉米夫定、泛昔洛韋等)更易于被磷酸化,而這可能是其對HBV有高活性的原因之一。恩替卡韋口服吸收良好,生物利用率高,達峰時間 Tmax為0.61～1 h,峰濃度Cmax為4.3～6.7 ng·mol-1,血藥溶液曲線下面積AUC為15～17.8 ng·h-1·mL-1,其組織分布廣泛,以腎臟內濃度最高,血漿酶結合率低,恩替卡韋三磷酸脂的半衰期為14～15 h,體內代謝率低,主要以原形從腎臟排泄。若腎功能不良,可能會影響該藥的清除。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

6410型高效液相色譜-串聯質譜聯用儀:美國Agilent公司產品,其中安捷倫1200高效液相色譜系統包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱;串聯質譜儀為Agilent6410型三重四極桿串聯質譜儀,包含電噴霧離子化源以及串聯三重四極桿質譜檢測器。色譜工作站:MassHunter數據處理軟件,美國Agilent公司產品;GL-88B旋渦混合儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品;AB104電子分析天平:瑞士 Mettler Toledo公司產品;Sigma 2K-15型高速低溫離心機:美國Sigma公司產品;Milli-Q Plus純水器:美國密理博中國有限公司產品。

1.2 主要試劑

恩替卡韋對照品(含量99.68%):由中國藥品生物制品檢定所提供;地西泮對照品(內標,批號:1230-9601):由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇(色譜純):DIMA公司產品;乙腈(色譜純):DIMA公司產品;實驗用水為去離子水,本實驗室自制。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Waters-Eterra MSC18柱 (2.1×50 mm×5μm);流動相:甲醇-水(5 mmol·L-1碳酸氫銨),梯度洗脫;流速: 0.3 mL·min-1;柱溫:20℃;進樣量:10μL。

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子化源 (ESI源),正離子模式檢測,多反應監測 (MRM)方式,噴射電壓5 500 V;離子源溫度350℃;源內氣體1 (GS1,N2)壓力 2.07×105Pa,源內氣體 2 (GS2,N2)壓力4.14×105Pa,氣簾氣 (N2)壓力6.90×104Pa,碰撞氣 (N2)壓力6.90×104Pa,碰撞電壓15 V;碎裂電壓110 V。以多反應監測的質譜掃描方式分析,測定恩替卡韋和內標的正離子對分別為 m/z278.2→152.1,m/z 285.0→193.0,示于圖1。

圖1 恩替卡韋(a)和內標地西泮(b)的產物離子掃描質譜圖Fig.1 Full-scan product ion spectra of[M+H]+for entecavir(a)and diazepam(b)

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品預處理 精密量取50μL血漿樣品,置于1.5 mL EP試管中,分別加入50μL內標溶液 (5μg·L-1地西泮溶液)和50μL甲醇,并補加1 000μL甲醇溶液,渦旋混合均勻,在4℃下以15 000 r·min-1轉速離心10 min,取上清液800μL,在50℃水浴中吹氮氣揮干,200 μL流動相復溶,進樣 10μL,HPLC-MS/MS分析。

1.4.2 標準曲線和質控樣品的制備 精密稱量10.0 mg(按無水計算)恩替卡韋,置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,得恩替卡韋濃度為400.0 mg·L-1,作為儲備液備用,然后用空白血漿依次稀釋配成濃度為0.05、0.1、0.25、1、2.5、7.5、15、20μg·L-1的標準含藥血漿。按照1.4.1項所描述的方法進行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.25、2.5、15μg·L-1的質控樣品。

1.4.3 穩定性考察 在不同的實驗條件下對質控樣品進行穩定性實驗(n=3)。

1)質控樣品在-40℃冰箱中完全冷凍后取出,在室溫環境下解凍,然后再次放入冰箱,如此反復3次后制備并測定;

2)質控樣品在室溫下放置 4 h后制備并測定;

3)質控樣品在-40℃下避光保存,1個月后制備并測定;

4)質控樣品在進樣器放置 4 h后制備并測定。

2 方法與結果

2.1 特異性考察

分別取6個不同受試者的50μL空白血漿,除不加入內標溶液并補加50μL甲醇外,其余按血漿樣品分析方法處理,進樣10μL,獲得空白樣品的色譜圖,示于圖2a;將一定濃度的恩替卡韋標準溶液和內標地西泮溶液加入空白血漿中,依同法進行樣品處理,獲得相應的色譜圖,示于圖2b(最低定量限)、圖2c(標準曲線中間濃度);取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法進行樣品處理,獲得相應的色譜圖,示于圖2d。結果表明,空白血漿中的內源性物質不干擾恩替卡韋和地西泮的測定。

2.2 相對基質效應考察

分別取6個不同受試者的50μL空白血漿于1.5 mL EP試管中,然后各加入50μL恩替卡韋最低濃度 (0.05μg·L-1)標準溶液和50 μL內標,按1.4.1項操作,進樣量10μL,每個空白血漿做3份;并同時做1條隨行的標準曲線,根據標準曲線計算血漿樣品的實測濃度。結果顯示,所有實驗測定值與標示量的相對偏差均在±20% 之間,精密度為 10.04%(小于15%),可認為沒有基質效應干擾。

2.3 標準曲線和線性范圍

以待測化合物和內標峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,權重系數1/X2,進行線性回歸計算,得標準曲線示于圖 3。線性相關系數 r為0.996 4,而且各點標示濃度和計算濃度的偏差都在±15%以內(最低定量限為±20%),最低定量濃度為0.05μg·L-1。

2.4 精密度和準確度

方法學考核濃度為0.25、2.5、15μg·L-1, n=6,(方法學考核批次)為3次,結果列于表1。結果表明,此方法的精密度和準確度偏差均在±15%以內。

2.5 穩定性

分別在-40℃反復凍融3次、血漿室溫放置4 h、-40℃下凍存1個月、進樣器放置4 h (n=3),4種條件下考察方法的穩定性,結果列于表2。結果表明,恩替卡韋在這4種條件下的穩定性良好。

2.6 相對回收率試驗

取1.5 mL EP試管數支,制備含恩替卡韋濃度分別為0.25、2.5、15μg·L-1的質控樣品,按1.4項操作,記錄色譜圖,計算恩替卡韋峰面積 As和內標峰面積 Ai的比值 f,將 f代入當天的標準曲線方程,計算實測濃度與加入濃度的比值即為準確度 (相對回收率),結果顯示,低、中、高濃度的相對回收率分別為 107.33%、102.47%、105.22%。

2.7 方法應用

應用本方法測定36名中國成年健康志愿者單劑量口服1 mg恩替卡韋后,不同時間血漿中恩替卡韋的濃度,并計算藥代動力學參數。平均血藥濃度-時間曲線示于圖4。藥代動力學參數結果為 Cmax:(7.63±1.91)μg·L-1;Tmax: (0.67±0.22)h;t1/2:(62.35±22.36)h; AUC0-tn:(22.80±4.19)μg·h·L-1;AUC0-∞: (29.08±4.57)μg·h·L-1。

圖2 血漿中恩替卡韋(Ⅰ)和內標地西泮(Ⅱ)的典型MRM色譜圖a.空白血漿色譜圖; b.空白血漿中加入0.05μg·L-1恩替卡韋和5μg·L-1內標地西泮的色譜圖; c.空白血漿中加入2.5μg·L-1恩替卡韋和5μg·L-1內標地西泮的色譜圖; d.志愿者口服1 mg恩替卡韋0.75 h后的血漿樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of entecavir(I)and diazepam(IS)(II)in humen plasma a.blank plasma;b.standard curve sample(0.05μg·L-1)added IS(5μg·L-1); c.standard curve sample(2.5μg·L-1)added IS(5μg·L-1); d.plasma sample from a healthy volunteer 0.75 h after oral administration of 1 mg entecavir

圖3 HPLC-MS/MS法測定人血漿中恩替卡韋的標準曲線Fig.3 The typital calibration cure for entecavir in human plasma

表1 恩替卡韋回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of entecavir

表2 恩替卡韋穩定性Table 2 Stability of entecavir

3 討 論

本實驗建立了血漿中恩替卡韋的 HPLCMS/MS測定法,血漿中的雜質不干擾樣品的測定,標準曲線線性范圍為0.05～20μg·L-1,線性關系良好;高、中、低3個濃度的批內和批間精密度均小于15.0%;相對回收率在102.47%～107.33%之間;恩替卡韋血漿樣品室溫放置 4 h,-40℃下反復凍融3次,-40℃下凍存1個月及檢測樣品進樣器放置4 h條件下的穩定性良好,符合生物樣品分析要求。采用沉淀蛋白法后揮干的方法處理血漿樣品,相比固相萃取法操作簡單,節約成本,最低定量限為50 pg,滿足本研究藥代數據的需要。

圖4 36名健康志愿者口服1 mg恩替卡韋后的平均血藥濃度-時間曲線Fig.4 Mean plasma concentration-time profile of amycin in 36 healthy volunteers after oral administration of 1 mg entecavir

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Quantitative Determination of Entecavir in Human Plasma by HPLC-MS/MS

HAO Guang-tao1,LI Yuan-yuan1,HE Shi-xue2,CHEN Gang1, GAO Hong-zhi1,LIU Ze-yuan1
(1.A f f iliated Hospital,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100071,China; 2.Harrison International Peace Hospital,Hengshui053000,China)

Entecavir in human plasma was determined by high performance liquid coupled with-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Diazepam was used as internal standard. Entecavir was separated on a Waters-Eterra MS-C18column(2.1×50 mm×5μm).Electrospray ionization(ESI)source was applied,and multiple reaction monitoring(MRM)mode was operated in the positive mode with the monitor ions atm/z278.2→152.1 for entecavir andm/z285.0→193.0 for the internal standard,respectively.The linear calibration curve is obtained over the concentration range of 0.05—20μg·L-1.The limit of quantitation is 0.05μg·L-1(n=6).The inter and intra-day precision(RSD)is less than 15%.The average recoveries are above 75%.

entecavir;high performance liquid chromatography coupled with-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);plasma concentration

O 657.63;R 927.2

A

1004-2997(2010)04-0252-05

2009-10-21;

2010-02-02

郝光濤(1980～),男(漢族),甘肅慶陽人,藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13146323056@m165.com

劉澤源(1961～),男(漢族),山西太原人,主任藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13311010528@m165.com