正相HPLC-MS/MS法測定人體血漿中西酞普蘭對映異構體濃度

向 瑾,余 勤,張 成,梁茂植,南 峰,秦永平

(四川大學華西醫院GCP中心臨床藥理研究室,四川成都 610041)

正相HPLC-MS/MS法測定人體血漿中西酞普蘭對映異構體濃度

向 瑾,余 勤,張 成,梁茂植,南 峰,秦永平

(四川大學華西醫院GCP中心臨床藥理研究室,四川成都 610041)

建立了正相高效液相色譜-串聯質譜 (HPLC-MS/MS)法測定人體血漿中西酞普蘭(citalopram,CIT)對映異構體濃度。采用CHIRALCEL OJ-H(250 mm×4.6 mm×5μm)手性柱,利多卡因作為內標,流動相為V(正己烷)∶V(無水乙醇)∶V(二乙胺)=70∶30∶0.1的溶液,流速為0.5 mL·min-1。血漿樣品在堿性條件下用V(正己烷)∶V(異丙醇)=98∶2的溶液提取濃集后,選擇大氣壓化學電離源和多反應離子監測(MRM)模式進行測定。CIT和內標檢測離子對分別為 m/z325.1→108.9和 m/z235.4→86.1。rac-CIT的線性范圍為0.156～50μg·L-1,S-CIT的線性范圍為0.078～25μg·L-1,標準曲線的線性良好(r> 0.99)。rac-CIT、S-CIT和 R-CIT的方法回收率分別為99.7%～101.5%,99.1%～103.3%,99.9%～100.2%;萃取回收率分別為73.5%～75.1%,73.9%～76.0%,73.1%～74.3%。各組分的日內RSD和日間RSD均小于5.0%。

西酞普蘭;對映異構體;血藥濃度;高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)

西酞普蘭(citalopram,CIT)是一種選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑。與同類藥物相比, CIT對5-羥色胺的再攝取抑制性強、選擇性高,對其他攝取機制、神經遞質受體和酶類沒有或僅有非常微弱的作用,由于其耐受性好、副作用少的特點,已成為目前治療抑郁癥的一線藥物。西酞普蘭分子存在一個手性中心,臨床常以消旋體(rac-CIT)給藥,而國內外的藥理研究已經表明,右旋西酞普蘭(S-CIT)的抗抑郁作用比左旋西酞普蘭(R-CIT)至少強100倍[1]。OJ-H手性柱為纖維素類手性柱,由于水能溶解纖維素及其衍生物,故流動相一般采用正相系統。本實驗選擇大氣壓化學電離源和多反應離子監測(MRM)模式,建立測定西酞普蘭對映異構體血漿濃度的正相HPLC-MS/MS法,可用于西酞普蘭對映異構體血漿濃度的測定和藥代動力學研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與色譜條件

SIL-HTc型高效液相色譜儀:日本島津公司產品;API 3000三重四極桿串聯質譜儀:美國 Applied Biosystems公司產品。CHIRALCEL OJ-H手性柱(250 mm×4.6 mm×5μm), phenomenex氰基預柱(4 mm×3 mm×5μm),柱溫為室溫,流動相為V(正己烷)∶V(無水乙醇)∶V(二乙胺)=70∶30∶0.1的溶液,流速為0.5 mL·min-1。離子源為大氣壓化學電離源(APCI),離子源溫度350℃,碰撞活化氣(CAD) 9 kV,霧化氣 (NEB)流速4 L·min-1,氣簾氣(CUR)流速7 L·min-1。正離子MRM模式監測,西酞普蘭和內標利多卡因的檢測離子對分別為m/z325.1→108.9和 m/z235.4→86.1,離子去簇電壓(DP)分別為45 V和33 V,離子對碰撞活化電壓(CE)分別為42 V和27 V。

1.2 試劑與試藥

氫溴酸西酞普蘭化學對照品和草酸艾司西酞普蘭(S-CIT)對照品:純度99.5%,均由成都市科倫藥物研究所提供;利多卡因化學對照品:購自山西大同制藥廠;甲醇、正己烷和異丙醇:均為色譜純,TEDIA公司產品;其余試劑均為分析純。

1.3 標準溶液配制

精密稱取6.25 mg(相當于 rac-CIT 5 mg)氫溴酸西酞普蘭,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,即得50 mg·L-1rac-CIT儲備液,臨用前以甲醇稀釋 rac-CIT標準系列工作液,分別為 250、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562和0.781μg·L-1;精密稱取3.2 mg(相當于S-CIT 2.5 mg)草酸艾司西酞普蘭,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,即得25 mg·L-1S-CIT儲備液,臨用前以甲醇稀釋S-CIT標準系列工作液,分別為125、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781和 0.391 μg·L-1;精密稱取6.2 mg(相當于利多卡因 5 mg)鹽酸利多卡因,置于100 mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,即得內標儲備液(50 mg·L-1),臨用前以甲醇稀釋為4μg·L-1的內標工作液。

1.4 樣品預處理

取500μL血漿,加入50μL內標工作液和100μL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液,混勻后加入3 mLV(正己烷)∶V(異丙醇)=98∶2的萃取劑,漩渦萃取 10 min,低溫離心 10 min(16 ℃, 3 000 r·min-1),轉移上層有機相于干凈尖底試管中,置于40℃水浴中,通空氣流揮干,殘留物溶于100μL流動相,進樣40μL。由藥物與內標的峰面積比對藥物濃度進行加權(1/c2)線性回歸。

rac-CIT的濃度以 R-CIT和 S-CIT的峰面積之和與內標峰面積之比,通過 rac-CIT標準曲線計算;S-CIT的濃度以 S-CIT的峰面積與內標峰面積之比,通過 S-CIT標準曲線計算;RCIT的濃度為rac-CIT與S-CIT的濃度之差。

2 結果與討論

2.1 檢測方法的選擇

CIT同時具有紫外和熒光吸收,一般說來,熒光檢測靈敏度較紫外高。陳國珍等[2]指出:許多共軛芳香族化合物,激發時發生π→π躍遷,其熒光光譜受溶劑極性的影響較大。由于這些分子受激發時,其電子激發態比基態具有更大的極性,隨著溶劑極性的增大,對激發態比基態產生更大的穩定作用,因此π→π躍遷所需的能量差小,且躍遷幾率增加,熒光光譜隨著溶劑的極性增大而向長波方向移動,強度也會增加。但本實驗發現,在濃度相同的情況下,采用紫外檢測時藥物的響應比熒光檢測高20多倍。這是由于OJ-H手性分析柱的特殊要求,流動相采用低極性的正己烷/無水乙醇系統,CIT在正相溶劑系統中進行π→π躍遷,所需的能量差增大,且躍遷幾率減小,強度也就大大減小。雖然其紫外響應較熒光響應高,但仍不能滿足藥動學測定的需要,故最終采用HPLC-MS/MS法測定西酞普蘭對映異構體血藥濃度。

2.2 離子源的確定

本實驗比較了電噴霧離子源(ESI)和大氣壓化學電離源(APCI),結果顯示,在相同流速下,采用ESI源,藥物響應只是采用APCI源的20%左右。這可能因為流動相為正相,ESI源不利于CIT的離子化。在不分流的條件下,ESI源的流速不能超過0.3 mL·min-1,此時CIT消旋體達到基線分離所需的保留時間為30 min; APCI源流速可達2 mL·min-1,當流速為0.5 mL·min-1時,CIT消旋體達到基線分離的保留時間大大縮短(tR<15 min),故本研究采用APCI離子源。有文獻[3]報道正相 HPLC-MS/MS法易發生爆炸,本研究將離子源溫度設定為350℃,提高了正相HPLC-MS/MS法的安全性。

2.3 離子對的選擇

本實驗采用正相HPLC-MS/MS法,流動相采用低極性的正己烷/無水乙醇系統,故藥物的解離程度將直接影響測定靈敏度。國外學者常在柱后添加甲酸,醋酸銨以提高正相 HPLCMS/MS條件下藥物的響應[4-5]。本實驗在進行針泵掃描時,也考察了添加甲酸、醋酸銨對藥物離子化的影響,結果顯示,柱后添加甲酸未能提高CIT的響應,添加醋酸銨也未出現預期的m/z342([M+NH4]+),故未采用柱后添加的方法。CIT和內標的二級質譜圖示于圖1。

圖1 西酞普蘭(a)和內標(b)的MS2掃描質譜圖Fig.1 MS2spectra of citalopram(a)and internal standard(b)

2.4 流動相的優化

在手性分離過程中,一些強堿、強酸類物質容易吸附在手性色譜柱上,從而造成色譜峰形展寬和拖尾,這些吸附一般存在于填料上的活性點。為了避免這種情況,可以在流動相中加入一些添加劑,這些物質比待分析樣品更容易吸附在填料上,這樣填料上的活性點對待分析樣品而言就被屏蔽掉了。由于西酞普蘭是弱堿性藥物,故需要在流動相中加一定量的堿性添加劑,實驗最后選定二乙胺作為堿性添加劑。

隨著流動相中醇比例的增加,藥物的保留時間減少,當醇的比例為30%時,R-CIT和S-CIT能達到基線分離,R-CIT和 S-CIT的保留時間分別是12.8 min和14.2 min,故最終確定流動相為V(正己烷)∶V(無水乙醇)∶V(二乙胺)= 70∶30∶0.1的溶液,流速為0.5 mL·min-1,柱溫為室溫。

2.5 血漿樣品預處理條件的選擇和優化

實驗考察了在不同濃度氫氧化鈉溶液(0.1、0.5、1 mol·L-1)中,CIT和內標的萃取回收率,通過實驗發現,隨著堿濃度的增加,萃取回收率逐漸增大,且高濃度堿液條件下,萃取揮干后的殘渣復溶溶液較澄清,故確定在1 mol·L-1氫氧化鈉的堿性條件下萃取。

國外學者對人體血漿中的 CIT進行研究時,預處理多采用2次萃取[6-7],且萃取劑體積較大。本研究在堿性條件下對萃取劑的篩選發現:正己烷的萃取回收率最低,不到50%;乙酸乙酯和乙醚萃取揮干后的殘渣復溶后,溶液較混濁;二氯甲烷萃取時的萃取回收率不穩定;用V(正己烷)∶V(異丙醇)=98∶2的溶液萃取時,樣品基線噪聲較小,色譜峰的響應高,回收率恒定,故選擇含2%異丙醇的正己烷作為本研究的萃取劑。

2.6 方法學驗證

2.6.1 特異性考察 分別取空白血漿、空白血漿加標樣、受試者給藥后收集的血漿樣品,按上述血漿樣品處理方法及檢測條件進行定量分析,其色譜圖示于圖2。結果表明,血漿中的內源性雜質不會干擾R-CIT、S-CIT及其內標的測定。

圖2 空白血漿(a)和空白血漿加S-CIT對照品(b)、空白血漿加 rac-CIT對照品(c)和給藥后血漿(d)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma(a),blank plasma withS-CIT(b), blank plasma withrac-CIT(c)and sample plasma(d)

2.6.2 標準曲線 以藥物與內標的峰面積比為橫坐標(x),血漿藥物濃度為縱坐標(y)進行線性回歸 (1/c2),rac-CIT 在 0.156～ 50 μg·L-1范圍內,回歸方程為:y=0.214 3x+ 0.001 8(r=0.999 2);S-CIT在 0.078～25 μg·L-1范圍內,回歸方程為:y=0.305 7x-0.003 2(r=0.999 2)。

2.6.3 精密度、方法回收率和萃取回收率 配制rac-CIT、S-CIT和R-CIT高、中、低3個濃度質控樣品,按1.4方法操作,分別在同一天內連續測定5次,連續測定3天,計算日內、日間精密度和方法回收率,均符合生物樣品分析要求;取空白血漿配制高、中、低三種濃度的質控樣品,按1.4方法操作,同時配制絕對進樣量相當于各濃度質控樣品100%含量的對照品工作液直接進樣,以藥物峰面積比計算藥物的萃取回收率,符合生物樣品分析要求。在經過預處理的空白血漿基質中加入rac-CIT、S-CIT和 R-CIT高、中、低3個濃度對照品溶液,記錄進樣得到的峰面積作為分子,以相應對照品溶液直接進樣得到峰面積作為分母,二者相比計算得基質效應,結果符合生物樣品分析要求。以上結果列于表1。

2.6.4 血漿樣品穩定性 配制rac-CIT、S-CIT和 R-CIT高(濃度分別為40、20、20μg·L-1)、中(濃度分別為2.50、1.25、1.25μg·L-1)、低(濃度分別為0.312、0.156、0.156μg·L-1)的質控樣品,分別于-30℃冰箱保存,考察樣品長期穩定性、反復凍融、室溫放置、重復進樣及萃取物穩定性實驗。實驗結果表明,血漿樣品4 h內重復進樣、室溫放置4 h、萃取物放置8 h、-30℃保存30天及反復凍融2次,與0時刻比較其分析物濃度無明顯變化,結果列于表2。

表1 西酞普蘭對映異構體的精密度、方法回收率和萃取回收率實驗結果Table 1 Results of precision,method recovery and extraction recovery of citalopram enantiomers

3 方法應用

10名男性健康受試者單次口服20 mg氫溴酸西酞普蘭片后,用本法測定其體內西酞普蘭對映體的濃度,血藥濃度-時間曲線圖示于圖3。結果表明,該方法可用于西酞普蘭對映異構體藥代動力學、生物利用度及臨床血藥濃度的測定。

圖3 血藥濃度-時間曲線Fig.3 Mean concentration-time curve of citalopram enantiomers

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Determination of Citalopram Enantiomers in Human Plasma with Normal Phase HPLC-MS/MS

XIANGJin,YU Qin,ZHANG Cheng,LIAN G Mao-zhi,NAN Feng,QIN Yong-ping
(Institute of Clinical Pharmacology,GCP center,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu610041,China)

A normal phase high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)method for the determination of citalopram(CIT)enantiomers concentration in human plasma was established.CHIRALCEL OJ-H column(250 mm×4.6 mm×5μm)was used.The mobile phase consisted ofn-hexane,alcohol and diethylamine (V(n-hexane)∶V(alcohol)∶V(diethylamine)=70∶30∶0.1).The flow rate of mobile phase was 0.5 mL·min-1.The analytes were determined using atmospheric pressure chemical ionization source and multiple reaction monitoring(MRM)detection mode,which was adopted to detect the concentration of CIT in positive mode.Lidocaine was used as internal standard.CIT and the internal standard are monitored atm/z325.1→108.9 andm/z 235.4→86.1,respectively.Calibration curves are linear in range from 0.156 to 50μg·L-1forrac-CIT,from 0.078 to 25μg·L-1forS-CIT and both the coefficient correlation were more than 0.99.Forrac-CIT,S-CIT andR-CIT,the relative recoveries are 99.7%—101.5%,99.1%—103.3%,99.9%—100.2%;the extraction recoveries are 73.5%—75.1%,73.9%—76.0%,73.1%—74.3%,respectively.The inter-day and intra-day RSDs of the determinations of all species are less than 5.0%.

citalopram;enantiomer;plasma concentration;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

O 657.63

A

1004-2997(2010)04-0214-06

2009-08-27;

2010-03-06

向 瑾(1981～),女(漢族),四川人,助教,從事臨床藥代動力學研究。E-mail:xiangjintoday@163.com

余 勤(1969～),女(漢族),四川人,副教授,從事臨床藥代動力學研究。E-mail:sunny9996@tom.com