采用經碳化二亞胺交聯(lián)的纖維蛋白凝膠作為可注射性軟骨細胞支架材料的研究

施越冬 郭銀鈴 徐劍煒

(復旦大學附屬中山醫(yī)院整形外科,上海 200032)

軟骨組織是人體內重要的支撐結締組織,但軟骨缺損的自身修復能力有限,組織工程技術[1]為軟骨的修復重建提供了一個新的發(fā)展方向。纖維蛋白由于其良好的可塑性、黏附性和生物相容性而成為組織工程軟骨的主要支架材料[2]。纖維蛋白凝膠作為軟骨細胞支架材料存在生物強度差和降解過快的缺點。本研究擬探討利用碳化二亞胺(EDC)增加纖維蛋白凝膠的交聯(lián)度、生物強度和抗降解能力的可能性,旨在更好地構建可注射性軟骨。

1 資料與方法

1.1 實驗相關試劑 纖維蛋白原凍干粉,凝血酶(Sigma),DMEM 培養(yǎng)液,胎牛血清(韓國吉諾),磷酸鹽緩沖液(PBS),II型膠原酶(Sigma),EDC(Pierce),0.4%臺盼藍(Sigma),LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Molecular Probes Inc),抗生素溶液：PBS液中含有青霉素 1000 U?mL-1,鏈霉素1000 U ?mL-1。

1.2 軟骨細胞 選自3月齡的豬耳廓軟骨。

1.3 主要實驗器材 無菌6孔培養(yǎng)板,骨蠟(強生),YHZ-22型恒溫振蕩器(江蘇太倉華美實驗設備廠),恒溫細胞培養(yǎng)箱,TDL-408B臺式離心機,光學顯微鏡(Olympus),熒光顯微鏡(Olympus),超凈臺等。

1.4 實驗方法

1.4.1 EDC與纖維蛋白原反應成膠的實驗條件

1.4.1.1 (1)凝膠樣本的制備實驗分成2大組：(1)纖維蛋白原用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成100 mg?mL-1,凝血酶 50 U?mL-1,EDC按照與纖維蛋白原不同的比例(1/10～10/10)的配比加入,按上述配好的纖維蛋白原溶液與凝血酶各1 mL加入骨蠟小格中,同時加入按上述分組稱量好的EDC,加入試劑同時用細針輕輕攪拌,觀察不同組別的凝膠化情況。(2)纖維蛋白原凍干粉用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別配制成100 mg?mL-1、200 mg?mL-1,EDC用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液配制成10 mg?mL-1、20 mg?mL-1、30 mg ?mL-1、100 mg?mL-1、200 mg ?mL-1、300 mg?mL-1的溶液。將配好的不同濃度的EDC溶液與纖維蛋白原溶液各1 mL加入骨蠟小格中。并分別置于室溫和37℃水浴中反應,觀察不同組樣本的反應情況。對照組：纖維蛋白原200 mg?mL+凝血酶100 U?mL。

1.4.1.2 凝膠塊的水解穩(wěn)定性檢測 將第1步各組反應所得到的凝膠塊用PBS緩沖液漂洗2遍后置于無菌6孔培養(yǎng)板,各加入等量的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,隔天換液,觀察樣本及培養(yǎng)液的變化情況。

1.4.1.3 凝膠塊的酶解穩(wěn)定性檢測 按前1步試驗得出的比較理想的配比,制備10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠塊,PBS漂洗后,置于6孔培養(yǎng)板,各加入5 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,觀察凝膠塊的消化降解情況,記錄樣本完全降解的時間。

1.4.1.4 按上步實驗檢測結果,選用較為理想的配比制備成同樣大小的凝膠塊,固定干燥后,送檢電鏡掃描,查看樣本的超微結構,并估計測量孔隙大小。

1.4.2 軟骨細胞在EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠支架中的生長情況

1.4.2.1 豬耳軟骨細胞的獲取 選用3個月齡體質量約50 kg豬耳廓軟骨,經麻醉、消毒,切取豬耳,剝除皮膚筋膜及軟骨膜,切成直徑＜1 mm的軟骨顆粒,用0.05%Ⅱ型膠原酶消化16 h,收集細胞,臺盼藍染色檢查細胞活力、計數。

1.4.2.2 體外軟骨組織工程樣本的制備 (1)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備(200 mg纖維蛋白原+5×106細胞)?mL-1的纖維蛋白原細胞懸液。EDC分別用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成100 mg?mL-1,200 mg?mL-1,300 mg?mL-1。(2)制作骨蠟小格,規(guī)格為5 mm×10 mm×10 mm。(3)將配好的纖維蛋白原細胞懸液分別與不同濃度的EDC溶液(各取200μL)加入骨臘小格中。加入試劑同時用細針攪拌均勻,置于37℃溫箱中反應6個h,每隔1 h攪拌1次,待標本凝結后撤去骨蠟。

1.4.2.3 各組樣本制作好后放入6孔培養(yǎng)板,加入等量含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天換液,觀察凝膠塊的變化,倒置光學顯微鏡下觀察細胞的生長情況及纖維蛋白凝膠的降解情況。

1.4.2.4 實驗的第 1,第 4,第 7,第10天,不同組別的標本各取1塊,用 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit對凝膠塊進行熒光染色,染色30 min后用PBS緩沖液漂洗2次。操作過程中嚴格注意避光,防止熒光淬滅。染色完畢后,將樣本置于玻片上,于正置熒光顯微鏡下觀察細胞的活力情況,用藍光激發(fā)可見活細胞呈綠色,用綠光激發(fā)死細胞呈紅色。

2 結 果

2.1 第1組實驗發(fā)現(xiàn)EDC/纖維蛋白原＞2/10的組別不能形成凝膠 凝膠化的強度均較對照組差,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),1周內均完全降解。

2.2 第2組實驗結果發(fā)現(xiàn)在37℃反應條件下,如表1的配比可形成比較理想的凝膠。

2.3 按表1分組配比制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠樣本,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)觀察1個月,各組培養(yǎng)液無渾濁,凝膠塊的大小和形態(tài)均無任何變化。

表1 4組凝膠組成配比

2.4 酶解穩(wěn)定性檢測 按表分組制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠塊,每組各加入5 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶,結果示對照組消化4 h后凝膠塊完全降解,實驗組(1)17 h完全降解,實驗組(2)和實驗組(3)消化24 h后凝膠塊仍未完全降解。

2.5 電鏡掃描結果 對照組為疏松多孔的網狀結構,結構不規(guī)則,孔隙大小約為50～150 μ m。實驗組的超微結構較對照組明顯緊致有序,且實驗組(1)＜實驗組(2)＜實驗組(3),孔隙大小分別為50～100μm、20 ～ 50μm和 10 ～ 30μm。

2.6 組織工程軟骨樣本體外培養(yǎng)結果

2.6.1 培養(yǎng)第1天,倒置顯微鏡下觀察,見各實驗組樣本內細胞分布均勻,形態(tài)完整。活細胞熒光檢測見各樣本細胞生存良好,實驗組(3)見少量死細胞。

2.6.2 培養(yǎng)第4天,倒置顯微鏡下觀察,見實驗組(1)的細胞仍保持著完整的細胞形態(tài),實驗組(2)可見部分細胞呈空泡狀,實驗組(3)細胞幾乎都是空泡狀。活細胞熒光染色檢測示對照組和實驗組(1)細胞活力良好,實驗組(2)見較多的死細胞,實驗組(3)凝膠塊中未見存活細胞。

2.6.3 培養(yǎng)第7天,對照組凝膠塊表面呈白色絮狀物,光學顯微鏡下見培養(yǎng)液中有少量游離的細胞。活細胞熒光檢測見對照組和實驗(1)組細胞存活良好,實驗(2)組大部分細胞死亡。

圖1 纖維蛋白原200 mg?mL-1,凝血酶 100 U?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

2.6.4 培養(yǎng)第10天,對照組凝膠塊體積減小了約1/4,強度下降明顯,培養(yǎng)板底部見較多的白色絮狀物,倒置光學顯微鏡下見培養(yǎng)液中游離細胞增多。實驗組(1)凝膠塊形態(tài)和強度仍無明顯變化。活細胞熒光檢測示2組樣本內細胞存活良好。

圖2 纖維蛋白原200 mg?mL-1,EDC100 mg?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

圖3 纖維蛋白原200 mg?mL-1,EDC200 mg?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

3 討 論

3.1 凝血酶通過酶解纖維蛋白原,使其α和β鏈釋放出纖維蛋白A肽和B肽,從而改變纖維蛋白原分子的電荷和構象,形成有活性的纖維蛋白單體,纖維蛋白單體通過氫鍵及靜電引力作用聚合成纖維蛋白凝膠。EDC作為蛋白交聯(lián)劑,通過與氨基反應形成可與氨基反應的O-酰基脲中間體進行快速多肽縮合反應。凝血酶本身是多肽蛋白,當EDC和凝血酶同時存在時,EDC同樣可作用于凝血酶,改變其分子結構,抑制其活性,EDC亦可作用于纖維蛋白原,阻礙其釋放肽鏈而不能被激活。因此在第1大組實驗中,各組反應難以凝膠化或僅在EDC濃度較低時形成穩(wěn)定性差的凝膠。

3.2 EDC作為交聯(lián)劑廣泛應用于化工行業(yè),近年來逐漸在組織工程學上的應用。EDC分子呈線性結構,作為多肽縮合劑和交聯(lián)劑,可用于羧基和氨基的縮合反應。EDC通過與氨基反應形成O-酰基脲中間體,可進一步與氨基反應形成多肽聚合物,或在N-羥基丁二酰亞胺(NHS)存在時進一步與羧基基團反應生成酯化物,增強了交聯(lián)效應。但是NHS溶液呈酸性,細胞生長條件難以控制,不適用于構建可注射性軟骨,因此在本研究中未用NHS。EDC交聯(lián)過程中不進入材料基質,而是生成水溶性的脲衍生物,細胞毒性小。目前EDC主要用于三維支架材料的交聯(lián)制備,近年來在人工真皮[3]、角膜[4]、血管內皮、軟骨等組織工程支架的實驗研究中已證明EDC作為交聯(lián)劑制備組織工程支架材料的可行性。

3.3 傳統(tǒng)的纖維蛋白凝膠作為細胞支架材料存在著生物強度差和降解時間過快的缺點。EDC通過與纖維蛋白分子上的氨基和羧基反應,使分子間相互反應聚合,形成比傳統(tǒng)纖維蛋白凝膠更為穩(wěn)定的化學結構。本研究結果表明,EDC交聯(lián)形成的纖維蛋白凝膠比傳統(tǒng)纖維蛋白凝膠有更好的生物強度,置入模擬細胞生長條件的環(huán)境中仍保持較好的穩(wěn)定性。進一步使用II型膠原酶對樣本進行消化降解檢測不同組別的酶解穩(wěn)定性,結果表明EDC交聯(lián)形成的纖維蛋白凝膠抗酶解能力明顯提高,且隨著EDC濃度的升高而增強。

3.4 電鏡掃描結果顯示,EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠較對照組有著更緊密有序的三維空間結構,平均孔徑逐漸縮小,交聯(lián)密度隨著EDC濃度的增加而加強。EDC在提高纖維蛋白凝膠穩(wěn)定性的同時又保留了支架的三維多孔空間結構。

3.5 本研究中所用的LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit的作用原理基于目前公認的2個衡量細胞生存活力的指標,包括細胞內酯酶活性和細胞膜的完整性,這是目前國際上公認的檢測細胞活力快速、有效的方法。用該試劑盒檢測凝膠塊中細胞的生存活力具有敏感、準確的特點。

3.6 EDC交聯(lián)過程中不進入凝膠基質,而是生成水溶性的脲衍生物,無細胞毒性。實驗過程中,實驗組(2)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 200 mg?mL-1)樣本內的細胞在培養(yǎng)1周時大部分死亡,實驗組(3)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 300 mg?mL-1)樣本內的細胞在培養(yǎng)第4天時全部死亡。可能有2種原因：(1)這2種支架材料空間結構太緊密,不能為細胞的生長提供足夠的空間,限制了培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質的流通,阻礙了細胞的生長,最終導致細胞死亡。(2)由于反應成膠的時間較長,反應過程中高濃度的EDC有一定的細胞毒性,影響細胞活力導致死亡。因此該2種實驗配比不適用于構建組織工程軟骨。

3.7 本研究結果表明,在實驗觀察期間,軟骨細胞在對照組(纖維蛋白原200 mg?mL-1+凝血酶100 U?mL-1)和實驗組(1)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 100 mg?mL-1)的支架材料中存活良好,在第10天仍保持較好的活力。而對照組在第7天開始出現(xiàn)降解現(xiàn)象,發(fā)生細胞從凝膠塊中脫離現(xiàn)象。而實驗組(1)在培養(yǎng)的第10天凝膠塊的形態(tài)和強度仍無明顯變化,說明該支架材料不僅能為細胞的生存提供足夠的條件,而且有更強的抗降解能力,具備構建組織工程軟骨的可能性。但是該實驗配比制備的纖維蛋白凝膠對軟骨細胞的增殖分化、細胞外基質的分泌沉積有無影響,以及是否能夠在大型動物體內成功構建組織工程軟骨尚需要進一步研究。

總之,適當濃度EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠在生物強度和抗酶解能力方面較傳統(tǒng)的纖維蛋白凝膠有明顯提高,所形成的多孔隙網狀結構能為細胞的生長提供足夠的空間,軟骨細胞在該支架材料內存活良好。但是過高濃度的EDC交聯(lián)形成的支架則限制了細胞的生長。

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