護(hù)牙素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響

丁小軍 龔逸明 張萍 沈毅 郭雪華 余優(yōu)成 顧章愉

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科,上海 200032;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科,上海 200011;3.上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所,上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200011)

富士(GC)護(hù)牙素是近年來(lái)研制出的主要用于釉質(zhì)再礦化治療的產(chǎn)品,在口腔正畸臨床被常規(guī)用于預(yù)防托槽周?chē)例X表面的脫礦,預(yù)防齲齒的發(fā)生。其主要成分是酪蛋白磷酸多肽-無(wú)定形磷酸鈣(casein phosphopeptide-amorphouscalcium phosphate,CPP-ACP)。CPP-ACP主要是通過(guò)釋放大量的活性鈣離子來(lái)促進(jìn)釉質(zhì)的再礦化[1]。但現(xiàn)有的研究[2]結(jié)果表明,生理狀況下,細(xì)胞外鈣濃度的增加是誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞脫離細(xì)胞周期進(jìn)行終末分化的主要原因。在口腔矯治過(guò)程中由于矯治器的刺激,口腔潰瘍的發(fā)生率大為增高,如果潰瘍發(fā)生的同時(shí)應(yīng)用GC護(hù)牙素,是否會(huì)通過(guò)鈣的釋放增加細(xì)胞外鈣濃度影響以上皮增殖為主的口腔潰瘍的愈合過(guò)程,尚無(wú)學(xué)者對(duì)此作相關(guān)研究。本研究通過(guò)GC護(hù)牙素對(duì)口腔黏膜來(lái)源的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系NB和NT細(xì)胞[3]增殖的影響來(lái)對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 BP-800酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀,GC護(hù)牙素(GC公司,日本),FACS Calibur流式細(xì)胞儀,PI/RNase Staining Buffer,Annexin V：FITC Apoptosis Detection Kit I,RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液,胎牛血清。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系NB和NT由中國(guó)口腔組織培養(yǎng)和收集中心提供。選用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后,用0.25%胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞,傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 四甲基偶氮唑鹽比色(MT T)法檢測(cè)GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NB和NT細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種細(xì)胞于96孔板中,接種密度為1×104?mL-1,每孔接種0.2 mL。24 h后,分別換用GC護(hù)牙素濃度為0(對(duì)照組)和10-3(實(shí)驗(yàn)組0.05 g GC護(hù)牙素溶解于100 mL培養(yǎng)液中)的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換培養(yǎng)液1次,每天采用MTT比色法于490 nm處測(cè)定細(xì)胞吸光值,連續(xù)測(cè)定8 d。每組每天設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NB和NT細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中,接種密度為1×105?mL-1。24 h后,分別換用GC護(hù)牙素濃度為0和10-3的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。處理24 h后,分別消化、收集各組細(xì)胞,每個(gè)樣本至少有1×106個(gè)細(xì)胞。PBS洗2次,1 mL 70%的PBS冰乙醇固定,4℃過(guò)夜后,PBS洗 2次,加入 0.5 mL PI/RNase Staining Buffer,常溫避光孵育15 min。上機(jī)測(cè)定各組細(xì)胞 DNA含量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)及處理同細(xì)胞周期檢測(cè)。消化后的細(xì)胞用PBS洗2次,Binding Buffer重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)(每管內(nèi)液體總體積為100μL)。加入 Annexin V-FITC 5μL,避光常溫孵育30 min后加入PI 5μL,避光常溫孵育5 min。加入400μL Binding Buffer補(bǔ)足體積。上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞增殖的影響 從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出,與對(duì)照組相比,10-3濃度的GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞的生長(zhǎng)有輕度抑制作用(圖1和圖2)。

圖1 GC護(hù)牙素對(duì)NB細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 GC護(hù)牙素對(duì)NT細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比,GC護(hù)牙素處理24 h后,NB和NT細(xì)胞的G0G1期和S期百分比有顯著差異。實(shí)驗(yàn)組G0G1期細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組,而S期細(xì)胞百分比則略有減少,見(jiàn)表1。

2.3 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比,10-3濃度的GC護(hù)牙素處理24 h后,NB和NT細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著差異,見(jiàn)表2。

表1 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(,%)

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05

表2 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞凋亡的影響(,%)

表2 GC護(hù)牙素對(duì)NB和NT細(xì)胞凋亡的影響(,%)

組別(GC護(hù)牙素濃度)n NB細(xì)胞 NT細(xì)胞對(duì)照組 3 6.24±2.38 6.86±1.97實(shí)驗(yàn)組 3 7.95±1.92 9.10±2.61

3 討 論

CPP-ACP同時(shí)具有抑制牙釉質(zhì)脫礦和促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化的作用。CPP黏附在牙面和菌斑上,抑制菌斑中變鏈菌的繁殖,減少酸的產(chǎn)生,同時(shí)與鈣離子和磷酸鹽離子作用并使之穩(wěn)定地保持在水溶非結(jié)晶狀態(tài);處于水溶狀態(tài)下ACP中的活性鈣離子和磷酸鹽離子可以滲入牙面,補(bǔ)充牙釉質(zhì)下齲損區(qū)的礦物質(zhì),生成羥基磷灰石或氟化羥基磷灰石,這樣不但限制了脫礦區(qū)的擴(kuò)展,同時(shí)也修復(fù)了已受損的牙體結(jié)構(gòu),有效地防止了牙面上的白斑形成和促使已生成的白斑消失[4-6]。近年來(lái),為更好的發(fā)揮 CPPACP的防齲效果,CPP-ACP已經(jīng)被加入一些產(chǎn)品中。這些產(chǎn)品包括市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到的無(wú)糖口香糖、薄荷糖、凝膠以及實(shí)驗(yàn)測(cè)試用的玻璃離子水門(mén)汀和運(yùn)動(dòng)飲料等[7]。GC護(hù)牙素目前已被廣泛用于正畸后白斑的預(yù)防和美白、潔治后的脫敏以及常規(guī)的口腔保健等。

Cehreli等[8]曾經(jīng)用不同稀釋濃度(10-3、10-4、10-6、10-8和 10-12)的 GC護(hù)牙素處理 L929細(xì)胞(小鼠肺成纖維細(xì)胞),以探討GC護(hù)牙素作為外傷離體牙轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了10-3和10-4濃度處理外,其他濃度處理的細(xì)胞均有不同程度的增殖;經(jīng)10-3和10-4濃度的GC護(hù)牙素處理的細(xì)胞迅速凋亡,經(jīng)10-6和10-8濃度的GC護(hù)牙素處理的細(xì)胞凋亡相對(duì)較少,而經(jīng)10-12濃度的GC護(hù)牙素處理的細(xì)胞則沒(méi)有發(fā)生凋亡反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,高濃度的GC護(hù)牙素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖確實(shí)具有一定的抑制作用。進(jìn)一步的細(xì)胞周期分析和凋亡檢測(cè)的結(jié)果顯示,經(jīng)10-3濃度的GC護(hù)牙素處理24 h后,無(wú)論是NB還是NT細(xì)胞,G0G1期細(xì)胞的百分比都有少量的增加,S期細(xì)胞的百分比則明顯下降。但GC護(hù)牙素對(duì)細(xì)胞的凋亡并無(wú)明顯的影響,說(shuō)明GC護(hù)牙素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并非是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

口腔潰瘍特別是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病[9-11]。而在口腔矯治過(guò)程中,由于矯治器的刺激,口腔潰瘍的發(fā)生率大為上升。上皮細(xì)胞的增殖是口腔潰瘍愈合機(jī)制中的一個(gè)重要組成部分。在矯治器刺激導(dǎo)致的潰瘍愈合過(guò)程中,如果在局部應(yīng)用GC護(hù)牙素防齲,CPP-ACP中釋放的活性鈣可能會(huì)使細(xì)胞外的鈣濃度持續(xù)提高。而根據(jù)Bikle等[2]的研究,細(xì)胞外鈣濃度的升高,會(huì)通過(guò)激活一系列的通路,最終使上皮中的角化形成細(xì)胞脫離細(xì)胞周期,停止增殖,表達(dá)分化指標(biāo)而發(fā)生終末分化。我們研究[12]的另一項(xiàng)結(jié)果也證實(shí),細(xì)胞外鈣濃度的增加確實(shí)可以促使口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的分化。這樣,應(yīng)用GC護(hù)牙素就可能通過(guò)升高口腔上皮細(xì)胞外的鈣濃度來(lái)影響潰瘍的愈合過(guò)程。盡管本研究的結(jié)果提示10-3濃度的GC護(hù)牙素有輕度抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的作用,由于臨床使用GC護(hù)牙素是以原產(chǎn)品1日1次或數(shù)次直接涂于牙面,初始作用濃度很高,之后由于唾液的稀釋濃度逐漸降低。本研究中,因?yàn)镚C護(hù)牙素10-3濃度是我們所能制備的最高濃度,與實(shí)際應(yīng)用的情況并非完全一致,口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞也不是真正的口腔潰瘍處的口腔黏膜基底細(xì)胞,所以,本研究只是對(duì)此作了初步的探討,最終的結(jié)論仍有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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