神經肽Y在鼻息肉組織中的表達及意義

李俊 黃新生 王建中 白廣平 石穎*

(1.復旦大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科,上海 200032;2.復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻咽喉科,*病理科,上海 201700)

鼻息肉(nasal polyps)是鼻腔鼻竇黏膜的常見慢性疾病,以極度水腫的鼻黏膜在中鼻道形成單發或多發息肉為臨床特征。鼻息肉在人群中患病率較高,盡管Hippocrates已對鼻息肉有過描述[1],但其發病機制至今尚未闡明,因此臨床上用藥物和手術治療后仍存在著鼻息肉復發的情況。

近年來隨著對鼻黏膜中非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經及其釋放的多種神經肽的深入研究以及鼻神經源性炎癥[2]概念的提出,越來越多的研究已經證明神經肽的局部釋放在調節生理或病理環境下鼻黏膜的血流和腺體分泌中起著重要的作用[3],神經肽的生理或病理作用依賴于肽能神經纖維在正常或病理組織中的具體分布及含量大小。本研究通過免疫組織化學的方法研究神經肽 Y(NPY)在人鼻息肉組織中的分布和含量,以及研究其在正常鼻黏膜組織中的表達差異情況,探討神經肽Y在鼻息肉發病中的作用,旨在為治療鼻息肉提供一條新的思路。

1 資料與方法

1.1 材料來源 實驗組60例,其中男性36例,女性24例,來源于2007年1月—2009年11月間就診于我院并初次進行鼻內鏡手術的患者,留取鼻息肉標本。根據1997年海口會議慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型分期標準[4],Ⅱ型1期22例,Ⅱ型2期8例,Ⅱ型 3期 11例,Ⅲ型19例,患者年齡18～67歲,平均年齡39歲。各病例均除外并發哮喘、囊性纖維化和免疫性疾病,且手術前1個月未應用激素、減充血劑和抗組胺藥。對照組36例,其中男性10例,女性26例,年齡37～66歲,平均年齡46歲。取同一時期因鼻前庭囊腫切除術中行鼻底引流造孔時取的鼻黏膜,而且全部病例經鼻竇CT證實為非慢性鼻竇炎鼻息肉各型患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材方法 術中所取的鼻黏膜和鼻息肉標本,經10%中性甲醛固定,常規石蠟包埋,連續切片4張 ,片厚 5μm。

1.2.2 所需試劑 兔抗人神經肽Y多克隆抗體以及DAB染色試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色及病理診斷 具體步驟略,實驗組及對照組標本均經病理診斷為鼻息肉或鼻黏膜。

1.2.4 免疫組織化學染色切片脫蠟至水,滴加3%過氧化氫溶液10 min,以阻斷內源性過氧化物酶;蒸餾水洗3 min,2次,PBS(pH 7.4)浸泡5 min;必要時進行抗原修復;PBS洗3 min,2次,滴加非免疫的動物血清15 mim。吸取多余液體,增加一抗37度孵育1～2 h,PBS洗3 min,3次;加生物素標記的二抗37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次,加鏈霉素抗生物素過氧化酶(三抗)37度孵育15 min,PBS洗3 min,3次;加DAB顯色劑,顯微鏡下控制反應時間;自來水沖洗,蘇木精輕度復染;脫水,透明,中性樹膠封片。

1.3 結果分析

1.3.1 定性分析 用已知的陽性片作陽性對照,PBS取代一抗作陰性對照,以排除非特異性染色。棕黃色顆粒為陽性神經纖維或細胞,陽性程度根據染色強度判斷。

1.3.2 定量分析 采用BI-2000多媒體彩色病理圖文分析系統(成都泰盟科技有限責任公司)對檢測結果進行分析。每張切片于100倍視野選取不相重疊的5個陽性部位,在同一標準測量窗下,測量鎖定區域內陽性物質的積分吸收度(IOD),取平均積分吸收度值(IODM)為該標本的測量結果。

1.3.3 統計學分析 選用Stata7統計軟件,行單因素方差分析或秩和檢驗。以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色 實驗組患者鼻息肉的神經肽Y(NPY)陽性纖維較對照組明顯減少并變細,陽性減弱,少量存在于鼻息肉基底部擴張的腺腔、血管周圍以及腺泡細胞之間,陽性細胞質內出現較淺的棕黃色顆粒,見圖1,2。

2.2 實驗組患者鼻息肉的NPY陽性細胞集中部位的平均積分吸收度(IODM)明顯低于對照組,見表1,差異有統計學意義。

圖1 NPY在鼻息肉中的表達(SP×200)

圖2 NPY在鼻黏膜中的表達(SP×200)

表1 兩組NPY的IODM比較 ()

表1 兩組NPY的IODM比較 ()

注：與對照組比較,*P＜0.05

實驗組 60 1427.18±129.54*對照組 36 1846.93±164.35

3 討 論

鼻息肉的病因和發病機制不明,目前認為是多種機制導致的慢性炎性過程的終末產物。至今已有中鼻道微環境學說、鼻變態反應、嗜酸性粒細胞炎癥和細菌超抗原學說等。中鼻道微環境的某些特性,使該部易感性增高。在炎性因子刺激下,上皮細胞和免疫活性細胞合成、釋放IL-5及多種炎細胞因子和炎性介質,使嗜酸性粒細胞在局部聚集、釋放多種毒性蛋白和細胞因子,致使血管通透性增高,血漿滲出、組織水腫,張力增高,上皮破裂繼之增殖,細胞外基質也隨之增生,血管、腺體長入,逐漸形成息肉[5]。

目前已經證實人鼻黏膜中不僅存在膽堿能和腎上腺素能神經纖維,還存在非腎上腺素能非膽堿能神經纖維(NANC)[6]。長期以來廣大學者認為膽堿能和腎上腺素能神經纖維在人鼻黏膜生理功能中起著主導作用,但是,隨著近年來對非腎上腺素能非膽堿能神經以及神經肽的深入研究,越來越多的事實已經證明神經肽的局部釋放在人鼻黏膜中起著重要的生理和病理作用[7]。鼻息肉形成的組織病理變化主要為血管擴張、外滲、組織水腫等現象,可用鼻黏膜中的非腎上腺素能非膽堿能神經釋放的神經肽來解釋[8]。神經肽主要包括P物質(SP)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、血管活性腸肽(VIP)、NPY、一氧化氮合酶(NOS)。NPY是哺乳動物中含量最高,分布最廣的神經肽,它屬胰多肽相關肽,是一種36肽酰胺,其基因定位于第7號染色體上,包括4個外顯子和3個內含子,基因表達受調節神經細胞的各種內分泌因子等很多因素的調節,NPY在鼻黏膜中主要存在于小動脈,少量存在于靜脈竇及黏膜下腺體[9]。NPY與NOS共存于NADPH(還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶)陽性神經纖維中[10],有時NPY也與降鈣素基因相關肽(CGRP)共存,并發揮收縮血管、調控鼻黏膜的微循環和腺體分泌等作用,具有抑制擴血管物質的作用[11]。Giger等[12]在研究慢性鼻竇炎患者時發現,鼻黏膜中炎癥細胞變得更密集而且NPY受體活性降低。Fang等[13]曾在20例患者的鼻息肉組織中發現NPY和血管活性腸肽(VIP)存在表達,而未發現P物質(SP)和降鈣素基因相關肽(CGRP)的存在,并據此推測NPY和VIP在鼻息肉形成中可能發揮作用。在麻醉的豬和人的鼻及氣管的組胺激發反應試驗觀察中,有學者[14]發現激活NPY受體可以拮抗由組胺激發的鼻阻力增加、腺體分泌增多等癥狀,這些癥狀的病理現象類似鼻息肉形成時的諸如血管擴張、外滲、組織水腫等病理現象。本研究的結果也表明對照組正常鼻黏膜組NPY陽性神經纖維主要分布于小動脈、靜脈竇以及腺體的周圍,而實驗組NPY陽性纖維在鼻息肉組織中分布明顯減少,陽性物質顏色較淺,只有少量分布在增生擴張的腺體周圍,與各文獻報道一致;其在兩組中的含量測定采用陽性纖維的平均積分吸收度作半定量分析,本研究發現NPY在實驗組鼻息肉組中的含量要明顯少于對照組,而且此差異具有統計學意義。因此,NPY在鼻息肉發病中很可能具有重要的作用。

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14 Malis DD,Grouzmann E,Morel DR,et al.Influence of TASP-V,a novel neuropeptide Y(NPY)Y2 agonist,on nasal and bronchial responses ecoked by histamine in anaesthetized pigs and in humans?[J].Br J Pharmacol,1999,126(4)：989-996.