抑癌基因RASSF1A與RASSF1B基因的關系

劉新法 陳明軍 謝國柱 陳吉祥

(1.江蘇省泰州市人民醫院,江蘇 泰州 225300;2.江蘇大學附屬醫院,江蘇 鎮江 212001)

人類惡性腫瘤都是多基因病變,其發生和發展不僅與細胞異常增殖的腫瘤基因(ocogene)變異及高表達有關,也直接和細胞中的抑制細胞突變和異常增殖的抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)功能失活相關。Dammnn等[1]利用酵母雙雜交篩選的方法從染色體3P21.3內120 kb長最小純合缺失區分離出一種能與DNA修復蛋白XPA相互作用的基因,由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)與小鼠RAS相關區域家族1(RAS association domain family 1)及小鼠RAS效應蛋白Nore1高度同源,遂命名為RAS相關區域家族1,即RASSF1基因。由于選擇性剪切和不同啟動子的使用,RASSF1基因至少存在7個不同的轉錄本(轉錄本A～G)。研究[2]發現,RASSF1基因能直接參與細胞周期的調控,在體內和體外能抑制細胞生長,并參與誘導細胞凋亡。

本研究通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法,檢測RASSF1家族中2個最主要的轉錄本在胃癌組織及相應癌旁組織中的表達情況,以及論證兩者之間有無相關協調表達,為基因治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 試驗材料 胃癌組織標本取自2009年1月—2010年2月在我院胃腸外科手術的胃癌患者,共40例,均經病理確診,所有患者術前未經放、化療。所有標本均在-70℃冰箱保存待用

1.2 cDNA的制備 以 Trizol方法提取細胞總RNA并純化,用MMLV反轉錄得到5種腫瘤細胞的cDNA。

1.3 RT-PCR 利用DNAstar軟件設計RASSF1家族2種轉錄本的特異引物,以人β-actin為內參,通過RT-PCR方法檢測這2種轉錄本在胃癌組織與癌旁組織的表達情況。引物序列如下：RASSF1A擴增引物為：5'ATTGCAAGT TCACCTGCCAC3'(上游引物),5'CTTCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);RASSF1B擴增引物為：5'AGCT TGAACAAGGACCTGT T3'(上游引物),5'CT TCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);以人β-actin為內參,引物序列為：5'GAGACCT TCAACACCCCAGCC 3'(上游引物)5'GGCGTACAGGTCTT TGCGGATG 3'(下游引物),反應條件：95℃2 min,94℃15 s,58℃30 s,72℃1.5 min,30個循環,72℃10 min。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統計學分析 所有數據分析均應用于SPSS 9.0軟件。組間比較采用卡方檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 總RNA的提取結果 提取胃癌組織與癌旁組織的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳的結果顯示,18S和28S條帶較為明顯,RNA的完整性和質量較好(圖1)。采用核酸檢測儀(Gene SpecⅢ)檢測,A260/A280值均在1.9～2.0,其結果與電泳的結果一致,各項指標均達到反轉錄要求。

圖1 瓊脂糖電泳檢測總RNA

2.2 2種轉錄本在胃癌組織與癌旁組織中的表達狀況 應用RT-PCR方法檢測上述2種轉錄本的表達狀況(圖2);RASSF1A基因在40例胃癌組織中表達缺失率為60.2%(24/40),在對應的癌旁組織中表達缺失率為22.3%(9/40),RASSF1B基因在40例胃癌組織中表達缺失率為37.5%(15/40),在對應的癌旁組織中表達缺失率為10%(4/40)。

2.3 2種轉錄本相關性分析 RASSF1A和RASSF1B在胃癌組織中的表達無顯著相關(P＞0.05)。RASSF1A基因在胃癌組織中表達明顯缺失,癌旁組織中表達量顯著高于胃癌組織(t=4.623,4.022,P＜0.05),兩者有顯著差異,RASSF1B基因在胃癌組織及癌旁組織中均有表達,但無顯著差異。

圖2 RASSF1基因2種轉錄本在胃癌及癌旁組織中的PCR擴增

3 討 論

有研究[3]表明,在一些基因家族中,各轉錄本之間存在協調表達,一旦表達平衡被打破,就會導致細胞不正常的增殖。因此,在不同的腫瘤組織中分析各轉錄本表達比例的變化可以分析各轉錄本與腫瘤發生間的關系。本研究結果表明,2個轉錄本的表達有較大差異,尤其是RASSF1A基因在胃癌及癌旁組織中的表達有顯著差異(P＜0.05)。盡管RASSF1B基因在胃癌及癌旁中表達不同,但是無顯著差異,并且兩個轉錄本基因在胃癌中的表達情況也無相關差異(P＞0.05)。

RASSF1A基因位于人類染色體3p21.3[4],是RASSF1基因家族A、B、C中的一員。其cDNA序列中含有 6 個外顯子(1α、2α β、3、4 、5 和 6)共1873 bp核苷酸,編碼由340個氨基酸組成的蛋白多肽,其相對分子量為38800,N端與富含半胱氨酸的甘油二脂或佛波酯結合區高度同源,也被稱作蛋白激酶C保守區,它的生物學功能目前還未完全了解。RASSFlB基因與 RASSF1A基因主要的差別在于中部存在少數氨基酸的不同剪接方式,在正常組織和腫瘤組織中均有表達。本研究發現RASSF1A基因在胃癌組織中的表達缺失率極高,將RASSF1A基因轉染入不表達該基因的癌細胞株后,可顯著抑制腫瘤細胞的克隆形成和非貼壁腫瘤細胞的生長,接種裸鼠后其成瘤生長能力也明顯下降,由此可以進一步認為RASSF1A基因在腫瘤發生發展中起到重要的抑制作用。可初步推斷RASSF1A基因可以作為腫瘤組織,尤其是胃癌的腫瘤血清標志物。關于這2個主要轉錄本的表達失衡機制與兩者之間的關系目前尚不明了,還需通過更大樣本量的腫瘤組織及不同的腫瘤細胞系作進一步研究。

1 Williams MD,Chakravarti N,Kies MS,et al.Implications of methylation patterns of cancer genes in salivary g land tumors[J].Clin Cancer Res,2006,12(24)：7353-7358.

2 Dammann R,Li C,Yoon JH,et al.Epigenetic inactivation of a ras association domain family protein from the lung tumor suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet,2000,25(3)：315-319.

3 Chen H,Suzuki M,NakamuraY,et al,Aberrant methylation of RASGF R2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2006,15：1281-1285.

4 Baksh S,T ommasi S,Fenton S,et al.The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death[J].Molec Cell,2005,18：637-650.