家蠶基因組P450基因家族的分析

周 權,王寶玉

(1.安徽農業大學研究生學院,安徽合肥 230036;2.阜陽師范學院附屬中學,安徽阜陽 236041)

家蠶基因組P450基因家族的分析

周 權1,王寶玉2

(1.安徽農業大學研究生學院,安徽合肥 230036;2.阜陽師范學院附屬中學,安徽阜陽 236041)

利用家蠶基因組mRNA和氨基酸數據庫對P450基因進行搜索,結果顯示:在家蠶基因組中發現77個P450基因,分別歸于18個P450家族和26個亞家族,其中有9個多基因家族,3個基因家族的成員超過10個,CYP4有20個成員,是一個典型的多基因家族。對P450基因進行正選擇、基因轉換和基序分析,結果表明:1個組(包含3個P450s基因)中檢測出了顯著的正選擇替換位點,在這1個組中,轉換事件的次數為3次。

家蠶;細胞色素P450;正選擇;基因轉換

細胞色素P450加單氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,P450s)是一類由超基因家族編碼的含血紅素和巰基的結合蛋白[1]。P450的重要特征是還原型細胞色素P450與CO結合形成的復合物,在波長450nm處有最大的特征性吸收峰(γ峰),細胞色素P450命名正是由來于此。P450的系統命名是根據氨基酸序列的相似程度作為劃分P450家族與亞家族的依據,并用數字和字母分別代表P450家族與亞家族的名字,同源性超過40%的為同一家族的基因成員,而同源性超過55%以上,則為同一亞族成員。P450廣泛分布于各種生物中,參與許多外源物質(如殺蟲劑、環境有毒物質)和內源物質(如激素、脂肪酸)的代謝,是重要的代謝酶系[2],如昆蟲的CYP6和CYP9及甲殼動物的CYP2都具有抗植物毒素的功能,果蠅的CYP18和東亞飛蝗CYP6H1分別參與蛻皮類固醇激素的代謝和活化。

家蠶(Bombyx mori)屬鱗翅目蠶蛾科,普遍存在,廣大桑農普遍飼養,是生態學、進化生物學和環境科學研究較為理想的模式生物。家蠶基因組數據庫于2003年由中國科學家率先公布,為研究家蠶中P450基因家族提供了條件。本文通過對家蠶全基因組P450基因種類的鑒定、正選擇方式和基因間序列重組和交換的評估來研究P450基因家族的進化規律。

1 材料與方法

1.1 全基因組P450基因的鑒定

以家蠶為研究對象,基因組序列與基因序列來自于silkworm genome數據庫(http://silkworm.genomics.org.cn/,下載時間2009年3月)。家蠶全基因組中P450首先用P450的HMM(Hidden Markov model)序列在本地家蠶 mRNA數據庫中進行TblastN(E value threshold>0.01)搜索,得到所有可能是P450類型基因的序列;再到相應的氨基酸數據庫尋找相對應的氨基酸序列,然后將這些基因序列對應的氨基酸序列分別通過 Pfam程序檢驗其是否含有 P450結構域。對所獲得的 P450基因在 http://www.cyped.uni-stuttgart.de/中,E-value小于等于1e-7的情況下作BLASTP比對,進行基因家族和亞家族的命名。

1.2 P450基因的分組

利用MEGA4.0對所有序列進行距離法(Neighbor -Joining method)系統樹的構建,對系統樹進化枝中的基因根據氨基酸相似度大于60%的標準分組。

1.3 P450基因正選擇和基因轉換分析

本文ω的計算使用PAML軟件包中的codeml程序,分別在不同的密碼子替代模型M7和M8下進行計算,這兩種模型的適合度通過likelihood ratio(LR)統計方法來檢驗。正選擇的氨基酸位點通過PAML中的Bayesian方法計算得到。組內基因間的序列交換檢驗采用 GENECONV1.81程序默認參數來完成。P< 0.05為具有統計意義的基因交換事件。

2 結果分析

2.1 家蠶P450的基因的種類和分組

對家蠶mRNA分析結果表明:家蠶基因組含有P450基因77條。根據它們的氨基酸序列相似程度劃分而歸屬于18基因家族和26亞家族,其中有9個多基因家族,3個基因家族的成員超過10個,CYP4有20個成員,占家蠶P450基因的26.0%。

圖1 家蠶P450基因的系統樹

并利用MEGA4.0對家蠶基因組77條P450基因編碼區的核苷酸序列排序,按距離法構建了系統樹(圖1),反映了77條P450基因之間的進化關系。為更好地分析基因正選擇和基因轉換,我們對其進行了分組,分組標準為系統樹進化枝中基因的氨基酸相似度大于60%。結果顯示:家蠶77條 P450基因中的44條序列可歸入12個組,而其余的9條基因序列因差異太大而不能被歸入任何一組。在這12組中,由于正選擇位點的 PAML分析以及基因轉換的 GENECONV要求最少有3條序列,因此,最終用于正選擇和基因轉換分析的序列共3組,包含11條序列。

2.2 家蠶P450正選擇、基因轉換及其相互關系

對P450基因3個組中的11條基因進行正選擇位點的分析,同時滿足下列兩個條件即判斷為顯著的正選擇:(1)對于M7-M8的LR檢驗,其結果2Δl的顯著程度根據其相對于χ2(d.f.=1)的分布值進行判斷,即當2Δl>3.84時,P<0.05,顯示為顯著;2Δl>10.83時,P<0.001,顯示為極顯著;(2)M8計算結果中ω> 1.0。結果顯示(表1):1個組,包含3條基因,符合上述條件,說明這些基因可能受到正選擇壓力作用。其中1個組,包含3條基因,利用M8中Bayesian方法檢驗出14個概率大于95%的正選擇氨基酸位點。

在11條 P450基因構成的3個組中,有1個組(包含4個基因)檢測出了統計上具有顯著意義的基因轉換事件(表2)。在 P450基因3個組中,檢測出顯著正選擇位點的基因共3個;檢測出參與基因轉換的基因2個;既沒有檢測出正選擇位點,又沒有檢測出基因轉換的基因6個(表2)。

表1 LR檢驗結果

表2 P450基因的正選擇和基因轉換的分析

表2中黑體序號代表處于正選擇壓力的組;黑體基因序列名稱代表參與基因轉換的基因。

3 討論

與果蠅(86個P450基因)和按蚊(105個P450基因)等昆蟲的P450家族相比[3],家蠶該基因家族的數量少于上述昆蟲。在果蠅和按蚊等昆蟲中P450含有較多的CYP4和CYP6家族,而家蠶P450含有較多的CYP4、CYP6和CYP9家族。其中CYP4家族基因可能與氣味分子代謝有關,使嗅覺組織免受傷害,同時也有報道它們可能與氣味識別有關。CYP6A與外源性毒物代謝有關,CYP6B主要是被植物毒素所誘導[4,5],同時也被植物信號分子所激活。這也許是由于不同昆蟲的生活環境和習性不同所致,從而使它們的代謝途徑和抗外源化合物機制不同。

研究表明,在表面受體蛋白、寄主防御系統(如人類的MHC)、植物NBS-LRR和哺乳動物的P450基因中,正選擇作用都普遍存在[6]。我們使用 PAML程序對P450基因家族11條序列進行正選擇分析,其中3條P450基因序列中含有顯著性的正選擇位點。Healther等(2006)研究發現CYP1A亞家族基因旁系同源(paralog)存在正選擇現象,正選擇區域主要位于底物結合位點SSR3、SSR4和酶催化有關的位點Helix I。da Fonseca(2007)研究顯示哺乳動物 P450基因的正選擇位點也主要存在于底物結合位點(SSR)。可見,底物結合位點和酶催化相關位點的正選擇有利于P450根據環境中多樣的內源和外源化合物來拓寬和改變底物的專化性。家蠶P450基因的正選擇位點是否也存在于底物結合區有待于研究。

因為GENECONV程序不能嚴格區分不等價交換與經典的基因轉換,我們所研究的基因轉換其實包含了經典的基因轉換和基因間的不等價交換兩層含義,這在多基因家族的進化中起著重要的作用。家蠶P450基因家族3個基因組中,有1個組(包含2個基因)檢測出了具有統計上顯著意義的基因轉換事件。基因轉換事件發生頻繁的基因更容易受正選擇作用的原因可能是,頻繁發生基因轉換的基因更容易受到正選擇而得以保存,當然,受正選擇壓力的基因不僅只有基因轉換這一種突變方式,點突變等其它突變方式也可能被選擇保存。

[1]DoddapaneniH,ChakrabortyR,YadavJS.Genome-wide Structural and Evolutionary Analysis of the P450 Monooxy Genase Genes(P450ome)in the White Rot Fungus Phanerochaete Chrysosporium:Evidence for Gene Duplications and Extensive Gene Clustering[J].BMC Genomics, 2005,6:92-116.

[2]Li L,Cheng H,Gai J et al.Genome-wide IdentiWcation and Characterization of Putative Cytochrome P450 Genes in the Model Legume Medicago Truncatula[J].Planta, 2007,226:109-123.

[3]Poupardin R,Reynaud S,Strode C et al.Genomic Analysis of Detoxification Genes in the Mosquito Aedes Aegypti [J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2008,38 (1):113-123.

[4]Wen,Z.M.,Berenbaum,M.R.,and Schuler,M.A.Inhibition of CYP6B1-mediated Detoxification of Xanthotoxin by Plant Allelochemical in the Black Swallow (Papilio polyxenes)[J].Journal of Chemical Ecology,2006,32(3): 507-522.

[5]Grubor,V.D.,and Heckel,D.G.Evaluation of the Role of CYP6B Cytochrome P450s in Pyrethroid Resistant Australian Helicoverpa Armigera[J].Insect Molecular Biology,2007,16(1):15-23.

[6]季軍,楊四海,田大成.水稻基因組中抗病基因正選擇方式及基因轉換的研究[J].中國農業科學,2007,40(9):1856 -1863.

A Genome-wide Analysis of P450 Gene Family in Silkworm

ZHOU Quan1,WAN G Bao-yu2
(1.Graduate School,A nhui A gricultural University,Hef ei230036,China;
2.The A f f iliated Middle School,Fuyang Teachers College,Fuyang230062,China)

A genome-wide analysis of P450 genes were performed in silkworm genome based on their mRNA and amino acid data.77 P450 genes,assigned into 18 gene families and 26 subfamilies,were identified,it contains 9 multi-gene family,3 gene family has more than 10 members in it.CYP4 have 20 members,is a typical multi-gene family.P450 genes of silkworm positive selection,gene conversion and base sequence analysis,results showed that:A group(including three P450s genes)detected significant site is to choose the replacement,in this one group,the number of conversion events 3 times.

silkworm;cytochrome P450;positive selection;gene conversion

Q969.9

A

1009-9735(2010)05-0074-03

2010-08-06

周權(1976-),男,安徽肥東人,助理研究員,在讀博士生,研究方向:分子生物學。