鵝不食草總有機酸的提取與分析

陳琦 王尚

鵝不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.)為菊科植物鵝不食草的干燥全草。據《本草綱目》記載有通竅，止咳之功。主治風寒感冒，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻淵流涕等。

主要含有甾醇類、黃酮類、三萜皂苷、揮發油、胺類，有機酸等成分。近年來，針對其所含甾醇類、皂苷類、黃酮類等成分［1］研究較多，但有機酸類成分作為其重要組成部分還未見

1 儀器與試藥

UV-1700型紫外可見分光光度計(日本島津);BP211D電子天平(德國賽多利司);超聲波清洗器;烘箱;水浴鍋;真空泵;加熱套;pH試紙;沒食子酸對照品(含量測定用，中國藥品生物制品鑒定所);鵝不食草(采于吉林長白縣);其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 鵝不食草總有機酸的提取［2，3］

2.1.1 超聲提取法 取鵝不食草粉末50 g加蒸餾水1000 ml浸泡1 h，超聲提取1 h，過濾，殘渣加蒸餾水1000 ml，再次超聲提取1 h，過濾，合并2次濾液，水浴鍋(60℃)上濃縮得浸膏，浸膏減壓真空干燥(60℃)，干品即為鵝不食草總有機酸提取物。

2.1.2 堿提酸沉法 取鵝不食草粉末50 g加入蒸餾水1000 ml浸泡1 h，超聲提取1 h，過濾，殘渣加蒸餾水1000 ml，再次超聲提取1 h，過濾，合并兩次濾液，加入飽和鹽酸乙醚萃取，乙醚層再用2%碳酸氫鈉溶液萃取，碳酸氫鈉水溶液用濃鹽酸調制，pH值到2，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機酸提取物。

2.1.3 酸沉后有機溶劑萃取法 精密稱取鵝不食草粉末200 g于5000 ml圓底燒瓶中，加蒸餾水3000 ml回流提取。提取三次，每次1.5 h，合并三次提取液，水浴鍋(60℃)上濃縮(相對密度1.05)，濃鹽酸調制濃縮液，pH值到2，用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯溶液，回收乙酸乙酯，并于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機酸提取物。

2.1.4 有機溶劑加酸水直接提取法 精密稱取鵝不食草粉末200 g于5000 ml圓底燒瓶中，在70%乙醇溶液中加入濃鹽酸，pH值到2，在圓底燒瓶中加入70%乙醇酸水溶液3000 ml，回流提取三次，每次1.5 h，合并三次提取液，水浴鍋(60℃)上濃縮(相對密度1.05)，用適量乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，并于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機酸提取物。

2.2 鵝不食草總有機酸的含量測定［4，5］

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取一定量沒食子酸的對照品，用無水乙醇將其溶解，定容配成沒食子酸(20.5μg/ml)儲備液。

2.2.2 試品溶液的制備 準確稱取以上四種方法所得鵝不食草總有機酸提取物各0.02 g，置25 ml容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，在精確量取1 ml樣品溶液置10 ml容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，即得樣品溶液。

2.2.3 最大波長的選擇 取沒食子酸標準品溶液及堿提酸沉法樣品溶液各1 ml，置10 ml容量瓶中，加無水乙醇5 ml，0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml，1%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵(1:1)混合液1 ml，搖勻，暗處放置5 min，加0.1 mol/LHCl至刻度，搖勻，暗處放置20 min，平行空白，在500～900 nm波長范圍內掃描。結果表明，對照品和供試品最大吸收波長在730 nm波長處，故選擇測定波長為730 nm。吸收光譜圖如下。

圖1 標準品與樣品吸收光譜圖

2.2.4 標準曲線的繪制 分別取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 ml，置10 ml容量瓶中，加無水乙醇至6 ml，按2.2.3項下方法進行測定，自“0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml”起，依法測定其吸收度。以含量(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標進行相關分析，得出回歸方程為:A=529.19C+0.0463，R=0.991。結果表明溶液濃度在 0.416μg/ml～2.08μg/ml范圍內，吸光度與濃度呈良好線性關系。

2.2.5 樣品含量測定 分別量取上述四種方法樣品溶液各1 ml，按2.2.3項下方法進行含量測定，自“0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml”起，依法測定其吸收度，用直線回歸法計算總有機酸含量。測定結果見下表。

表1 不同提取方法鵝不食草有機酸含量

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 精密稱取鵝不食草粉末50 g，按2.1.2項下提取方法進行提取，同時按2.2.5項下的方法進行含量測定，平行測定6次，記錄每次含量測定結果。實驗結果RSD為0.35%(n=6)，顯示精密度良好。

2.3.2 重現性實驗 按2.1.2項下提取方法提取鵝不食草總有機酸，平行制備6份，同時按2.2.5項下的方法進行含量測定。含量測定結果RSD為0.73%(n=6)，實驗重現性好。

2.3.3 穩定性實驗 精密稱取鵝不食草粉末50 g，按2.1.2項下提取方法進行提取，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 時，按2.2.5項下的方法進行含量測定，結果24 h內供試品溶液穩定性較好，RSD為0.612%。

2.3.4 加樣回收率實驗 精密稱取鵝不食草粉末50 g，精密加入沒食子酸對照品4 mg，平行6次，按2.1.2項下提取方法進行提取，同時按2.2.5項下的方法進行含量測定，記錄每次含量測定結果。平均回收率97.5%，RSD=1.91%。

3 討論

本實驗通過對鵝不食草總有機酸成分提取實驗的設計，最終確定堿提酸沉法為其最佳提取方法，總有機酸含量達到67%以上，遠遠高于其他三種提取方法。但采用碳酸氫鈉提取有機酸時未考慮酚性物質的溶解和酯類物質的水解，被溶解或水解掉的部分是否為有效成分，其水解后會不會影響藥物的療效等問題尚需進一步研究。

本實驗以鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，采用分光光度法測定鵝不食草有機酸含量，方法學考察結果表明，分光光度法法測定鵝不食草藥材中的總有機酸的方法簡便、快速、準確、重現性好，實用性強。

鵝不食草是我國東北地區常用中藥，有機酸類成分是其有效成分之一，但尚無對其含量測定的報道，本實驗對其所含有機酸定量的研究，可為其質量標準的建立提供方法學的參考，以控制藥材質量，保證臨床療效，為進一步開發鵝不食草資源奠定基礎。

［1］劉宇.鵝不食草的化學成分及生物活性研究進展.湖北中醫雜志，2005，27(5):52-53.

［2］王媚，吳皓，等.中藥有機酸類成分的提取分離及測定方法研究進展.南京中醫藥大學學報，2004，20(3):190-192.

［3］陳玉昆.中藥提取生產工藝學(下).沈陽出版社，1992:109.

［4］付煜榮，張萬明，陳桂敏，等.景天三七中沒食子酸和總酚酸含量測定.中成藥，2006，28(7):1016-1018.

［5］張穎，甄攀，馬媛媛，劉淑芬，等.吳茱萸中總皂苷、總黃酮和總酚酸的含量測定.河北北方學院學報，2008，24(3):27-33.