精氨酸中細菌內毒素檢查方法的研究

陳久艷 顧炳仁

精氨酸為氨基酸類藥，現行藥品標準采用家兔熱原法控制其質量［1］，目前尚未見其細菌內毒素檢查的報道。鑒于細菌內毒素檢查法具有靈敏快速、簡便易行、重現性好等優點，為擴大其應用范圍，我們對細菌內毒素檢查法應用于精氨酸的質控進行了實驗研究，以探討細菌內毒素檢查法取代兔熱原檢查法用于精氨酸產品質量控制的可行性。

1 實驗材料

1.1 試藥與試劑 精氨酸:白色粉末，規格:原料藥，批號:09021004、09021005、09021006，由蘇州東瑞制藥有限公司提供。細菌內毒素工作標準品:批號:150601-200861，效價:150 EU·支，由中國藥品生物制品檢定所提供。鱟試劑:批號:0807260，靈敏度:0.125 EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司生產;批號:0903311，靈敏度:0.125 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司生產，試驗前2批鱟試劑的靈敏度復核均符合規定。細菌內毒素檢查用稀釋劑II(調節供試品的堿性，以下簡稱稀釋劑II):批號:0903160，規格:4 ml/支，內毒素含量小于0.003 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 儀器 ZH-2型自動漩渦混合器，由天津藥典標準儀器廠生產;DC-3A型細菌內毒素檢查干式恒溫器，由南京三愛斯技術開發有限公司生產。

2 方法與結果

2.1 精氨酸中細菌內毒素限值的計算 按《中國藥典2005年版》［2］規定，細菌內毒素限值(L)由公式 L=K/M計算。其中，K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K值為5 EU/(kg·h);M為人每公斤體重每小時的最大給藥劑量，精氨酸為原料藥，根據其制劑鹽酸精氨酸注射液臨床使用最大劑量換算得到，M值為83 mg/(kg·h)。據此計算，精氨酸的L值為0.06 EU/mg，精氨酸是原料藥，考慮之后還有一個制劑生產過程，所以慎重起見，我們最后確定精氨酸的L值為0.01 EU/mg。

2.2 精氨酸稀釋度的確定 計算供試品最小有效稀釋濃度的公式為C=λ/L(L值為0.01 EU/mg，λ為鱟試劑的標示靈敏度)，當 λ 分別為 0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.062 EU/ml、0.031 EU/ml時，則供試品的最小有效稀釋濃度 C 應分別為 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml。

表1 精氨酸最高無干擾濃度實驗結果

由表1可見，當供試品溶液濃度≤12.5 mg/ml時，對兩個廠家的鱟試劑不產生干擾作用，也就是對λ=0.125 EU/ml以上靈敏度的鱟試劑無干擾。

2.3 干擾試驗

2.3.1 干擾試驗預實驗 試驗前驗證供試品熱原試驗均符合規定。為排除供試品溶液對細菌內毒素檢查的干擾，求出最高無干擾濃度，先進行干擾試驗預實驗。將3批精氨酸分別用稀釋劑 II配制成 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml 5個不同濃度的供試品溶液(NPC)，并配制此系列濃度中含2λ的供試品陽性液(PPC)。選擇兩個廠家的λ為0.125 EU/ml的鱟試劑，分別加入0.1 ml稀釋劑II溶解，再分別加入0.1 ml不同濃度的NPC和PPC，混勻后，于37℃保溫60 min，同時作陽性對照(PC)和陰性對照(NC)，試驗重復2管，結果見表1。

2.3.2 干擾確證試驗 為進一步確證供試品溶液對λ為0.125 EU/ml的鱟試劑是否存在干擾作用，用稀釋劑II和濃度為0.25 mg/ml的3個批號供試品溶液分別將細菌內毒素工作標準品配制成 0.250、0.125、0.062、0.031 EU/ml4 個濃度的系列內毒素標準溶液。再分別用兩個廠家的λ為0.125 EU/ml的鱟試劑實驗，同時做供試品溶液的對照，試驗重復4管，結果見表2。

由表2可見，內毒素標準溶液的Es值在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2λ)范圍內，而供試品的Et值則在0.5～2.0 Es(包括0.5Es和2.0 Es)范圍內，確證濃度為12.5 mg/ml的3個供試品溶液對λ為0.125 EU/ml鱟試劑無干擾作用。

表2 精氨酸干擾確證試驗結果

2.4 精氨酸的細菌內毒素檢查 取3個批號的精氨酸，分別用稀釋劑II配制成濃度為12.5 mg/ml的供試品溶液，然后用兩個廠家的λ為0.125 EU/ml鱟試劑進行細菌內毒素檢查，并設供試品陽性(2λ)、PC及NC，結果見表3。

表3 精氨酸的細菌內毒素檢查試驗結果

由表3可見，3批精氨酸細菌內毒素檢查均符合規定。

3 討論

本實驗考察了精氨酸是否對鱟試劑與內毒素的凝聚反應有干擾作用，結果證明將精氨酸按《中國藥典》2005年版(二部)附錄Ⅺ E中細菌內毒素檢查法試驗，對鱟試劑與內毒素凝聚反應沒有干擾，使用λ為0.125 EU/ml的鱟試劑進行細菌內毒素檢查是可行的，確證了細菌內毒素檢查法完全可以代替傳統的兔熱原法用于該制劑的質量控制。據此，提出精氨酸的細菌內毒素檢查參考標準:取本品，以能夠調節本品的pH值的緩沖液稀釋，依照《中國藥典》2005年版(二部)附錄ⅪE檢查，每1 mg精氨酸中含內毒素的量應小于0.01 EU。

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部).化學工業出版社，2005:831.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部).化學工業出版社，2005:附錄85.