HPLC-ELSD法測定雙瓜糖安膠囊中黃芪甲苷的含量

趙海欣 趙連中 鄧曉文 周明慧

黃芪為雙瓜糖安膠囊的君藥，其主要成分黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)［1］，作為含量測定指標。本品執行標準為國家藥品監督管理局標準(試行)WS-5838(B-0838)-2002，采用薄層色譜掃描法測定黃芪甲苷的含量，該方法過程較復雜，靈敏度低，重現性差。本文參考有關文獻［2-13］，采用 HPLCELSD法對制劑中的黃芪甲苷進行了含量測定方法的研究。通過方法學的系統考察和四批樣品的含量測定，建立了本品中該成分的含量測定方法。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 LC-10AT VP色譜系統(日本島津)，Varian 380-LC型ELSD 系統，Agilent-C18 色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，AS230自動進樣器(依利特)，CA-3型靜音無油空氣油泵(武漢科林普豐儀器有限公司)，AG135型萬分之一/十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO)，B5200S-DT超聲波清洗器(BRANSON);正丁醇為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水;黃芪甲苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，含量測定用(批號:110781-200613)。

1.1.2 樣品來源與處理 試驗用四批雙瓜糖安膠囊均為廣西桂西制藥有限公司生產，其批號分別為:090502，090503，090504，090505;黃芪及其他藥材均購自鹽城市健民藥店，經鑒定均為《中國藥典》正品。

1.2 方法

1.2.1 樣品液的制備 對照品溶液的制備精密稱取置五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h以上的黃芪甲苷對照品9.48 mg，置25 ml容量瓶中，加入適量的甲醇，超聲使溶解，加甲醇稀釋濃度為0.3792 mg/ml的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取供試品20粒，研勻并稱取5.0155 g，置三角瓶中，加甲醇25 ml，超聲提取30 min，過濾，殘渣加40 ml水，用正丁醇萃取 4次(20，20，20，10 ml)。合并正丁醇萃取液，用氨試液洗滌2次(40，40 ml)，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(20，20 ml)，將正丁醇液水浴蒸干，殘渣以適量的甲醇溶解，過0.45μm微孔濾膜定容于2 ml容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.3 陰性對照品溶液的制備 除去黃芪藥材，按處方量比例稱取其他各組分，按供試品的制備工藝制成黃芪甲苷陰性對照品，并按上述供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液2 ml。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動相為乙腈-水(30:70);蒸發光散射檢測器;流速1.60L/min;蒸發管溫度90℃;霧化器溫度 50℃;柱溫35℃。

1.2.5 系統適用性試驗 試驗結果表明，陰性對照品溶液的圖譜在黃芪甲苷峰位置處無假陽性峰，黃芪甲苷的保留時間約為12.589 min，且與相鄰的峰分離度為2.5，柱效按黃芪甲苷計為5836。

圖1 對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖

1.2.5 線性關系考察 配制10.42、20.84、41.68、69.47、104.20、156.30、208.40 μg/ml的黃芪甲苷溶液，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積;以黃芪甲苷峰面積的自然對數(lnA)為縱坐標，進樣濃度的自然對數(lnC)為橫坐標，得回歸方程lnA=1.5461lnC+5.9564，r=0.9995(n=6);結果(圖 2)表明，當進樣量在0.8336～10.4200μg范圍內時，黃芪甲苷對照品的進樣濃度的自然對數值與峰面積的自然對數值呈良好的線性關系，可以用外標法測定并計算供試品中黃芪甲苷的含量。

圖2 黃芪甲苷對照品線性回歸曲線

1.2.6 精密度試驗 取黃芪甲苷對照品溶液，按上述色譜條件進樣20 μL，連續測定6次，記錄黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.613%，表明儀器精密度良好。結果

見表1。

表1 精密度試驗結果

1.2.7 穩定性試驗 取上述供試品溶液，分別放置0、2、4、8、10、12 h后，依法操作測定黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.163%，表明黃芪甲苷在12 h內穩定性良好。結果見表2。

表2 穩定性試驗結果

1.2.8 重復性試驗 取同一批供試品6份，按上述供試品溶液的制備方法配制溶液，并按上述色譜條件進樣20 μL，記錄黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.291%，表明測定方法的重復性良好。結果見表3。

表3 重復性試驗結果

1.2.9 加樣回收率試驗 制備黃芪甲苷對照品0.1012 mg/ml的溶液。取1.0 ml(含0.1012 mg的黃芪甲苷)，在水浴上揮干溶劑。取已知含量的供試品(批號:20090502)35粒內容物(含量為0.0383 mg/g)，研細，約3g，精密稱定5份，置具塞錐形瓶中，照供試品溶液的制備方法配制溶液，依法測定，平均回收率為100.39%。結果見表4。

1.2.10 樣品的測定 取不同批號的雙瓜糖安膠囊各一份，記錄色譜圖。每批供試品溶液測定3次，以測得的峰面積的自然對數值取平均值按外標法計算含量。結果見表5。

2 結果

2.1 提取溶劑 以水為提取溶劑時譜圖中雜質峰較多，而以流動相為提取溶劑時幾乎無峰面積產生，所以本試驗參照中國藥典黃芪藥材的提取方法，選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2 提取方法 水浴加熱回流提取率較低，而超聲的提取率顯著提高。鑒于超聲的方法更簡便，本試驗采取超聲為提 取方法。

表4 加樣回收率考察結果

表51 供試品中黃芪甲苷的含量測定結果

2.3 提取時間 超聲提取20 min黃芪甲苷的含量明顯小于30 min，提取30 min與40 min的含量無明顯差異，故以超聲提取30 min作為供試品提取方法。

3 討論

3.1 樣品前處理方法研究 分別比較了正丁醇的提取次數及用量，結果表明提取3次，20 ml為最佳方法。此外，試驗中采用了氨試液對供試品進行處理，從而明顯增加黃芪甲苷的量。

3.2 與原試行標準中規定的處理方法相比 我們采用HPLC-ELSD法對過樹脂柱處理的樣品與未過樹脂柱處理的樣品進行了比較，結果表明二種方法色譜圖基本一致。

3.3 陰性對照品的選擇 供試品雙瓜糖安膠囊為多成分提取制得的中藥復方制劑，其處方組成中苦瓜干、山藥等均含有皂苷類物質。為排除非黃芪甲苷類雜質的干擾，本試驗依據處方量比例稱取除黃芪藥材以外的其他各組分，按供試品的制備工藝制成黃芪甲苷陰性對照品。

3.4 檢測器的選擇 由于黃芪甲苷僅在紫外200 nm左右波長處有弱的末端吸收，響應值很小，用紫外檢測器檢測，靈敏度低，方法可操作性差［14］。蒸發光散射檢測器(ELSD)是近幾年應用在色譜方面的新型檢測器，為質量通用型檢測器［15］，它的響應值取決于被測物質顆粒的數量和大小。HPLC-ELSD法在各類中藥材質量標準制定、中藥指紋圖譜規范研究以及中藥新藥質量標準和穩定性等領域將顯示很好的潛力。

3.5 ELSD檢測器影響因素 漂移管的溫度對噪音的影響并沒有明顯規律，氣體流速對響應值的影響是流速越大，粒子越小，散射光越弱，從而響應值越小。但流速降低，響應值變大，噪音也隨之增大［16］。最優的流速是在可接受噪音的基礎上，產生最大響應值的最低氣體流速。ELSD的載氣若采用壓縮機輸出空氣，則應注意實驗室的濕度。

3.6 測定黃芪甲苷含量 將峰面積與對照品的濃度分別取自然對數后在一定范圍內可得到理想的線性關系(r=0.9995)。這種現象與蒸發光散射檢測器的檢測機制一致［17］。

4 小結

該文不但參考了大量文獻資料，而且在資料提供的方法基礎上做了大量的試驗工作，通過試驗提供的數據，驗證了該方法的可行性，可以作為改進雙瓜糖安膠囊中黃芪甲苷含量測定質量標準的參考。

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