2株中國紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的研究

趙赟鑫, 劉開輝,2, 鄧百萬＊.2, 陳文強(qiáng),2, 耿直, 李娟花

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中723001;2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723001)

2株中國紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的研究

趙赟鑫1, 劉開輝1,2, 鄧百萬＊1.2, 陳文強(qiáng)1,2, 耿直1, 李娟花1

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中723001;2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723001)

自秦巴山區(qū)野生中國紅豆杉(Taxus chinensis)中分離的25株內(nèi)生細(xì)菌中篩選出2株具有較廣抑菌活性的菌株TC-3和TC-2,通過生物學(xué)特征研究和16S rDNA序列分析,初步鑒定為B acillus sp.和B acillus subtilis。在排除酸性產(chǎn)物和過氧化氫的干擾后,TC-3和TC-2菌株發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌(Escherichia coli)等革蘭氏陰性菌具有較好的抑菌作用,而且對部分真菌也有抑菌作用;經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后發(fā)酵液抑菌活性略有下降,表明該活性物質(zhì)為非蛋白成分,或起抑菌作用的非單一物質(zhì)。該活性物質(zhì)不同于一般細(xì)菌素,屬于類細(xì)菌素。它具有很好的熱穩(wěn)定性,在酸性條件下穩(wěn)定且活性高,對蛋白酶敏感性低,且具有較廣的抗菌譜。

紅豆杉;內(nèi)生細(xì)菌;抑菌;活性物質(zhì)

紅豆杉為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus L.)植物總稱。全世界有11種,分布于北半球的溫帶至熱帶地區(qū)[1]。中國有4種和1種變種:東北紅豆杉(T.cuspidataSieb.et Zucc.)、云南紅豆杉(T.yunnanensisChang et L.K.Fu)、西藏紅豆杉(T.wallichianaZucc.)、中國紅豆杉(T.chinensisRehd.)、南方紅豆杉(T.chinen sis var.maireiChang et L.K.Fu)[2]。

自從美國化學(xué)家Wall和Wani MC首先從太平洋紫杉(短葉紅豆杉T.brevif oliaNutt.)中分離出紫杉醇(Taxol)并于1971年發(fā)表其化學(xué)結(jié)構(gòu)[3],Schiff等證實紫杉醇具有獨特的抗癌機(jī)制[4], 80年代美國和歐洲的科學(xué)家相繼揭示出紫杉醇的抗癌療效[5]。1993年,美國Montana州大學(xué)植物病理系的Stierle博士等[6]從短葉紅豆杉(T.brevif oliaNutt.)的韌皮部中分離得到一種能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌安德魯紫杉菌(Taxomyces andreanae),目前有關(guān)紅豆杉內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌方面[7],有關(guān)紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌方面的研究報道尚少。

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi),并與植物建立了和諧關(guān)系的一類微生物。內(nèi)生細(xì)菌可以很容易地穿過植物皮層進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管中,隨著植物的生長可以將內(nèi)生細(xì)菌運送到植物上部營養(yǎng)器官或繁殖器官中。植物內(nèi)生細(xì)菌資源豐富,應(yīng)用前景廣闊,是抗菌藥物研究和開發(fā)的寶貴資源。目前,從植物內(nèi)生細(xì)菌中分離得到的抗菌活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)類型多樣,主要有萜類及其皂苷、生物堿類、芳香類、甾體類、肽類等,產(chǎn)生的活性物質(zhì)可用于抗癌、生防、抗菌等領(lǐng)域[8]。

隨著細(xì)菌素研究的不斷深入,一些不符合或不完全符合細(xì)菌素定義的拮抗物質(zhì)被陸續(xù)報道[9-12]。人們把這類物質(zhì)稱為類細(xì)菌素(bacteriocin-like substance)[10]。類細(xì)菌素通常具有一些特性,如較寬p H穩(wěn)定范圍,可抑制G-菌和真菌等[9]。這些特性決定了類細(xì)菌素具有比細(xì)菌素更為廣泛的應(yīng)用前景。近年來,對類細(xì)菌素的研究越來越多地受到人們的重視。關(guān)于類細(xì)菌素國外已有研究[9～12],而國內(nèi)尚未見報道。作者從自行分離的多株細(xì)菌中篩選出2株具有較廣抑菌活性的菌株TC-2和TC-3,經(jīng)鑒定為芽孢桿菌并對其產(chǎn)生的類細(xì)菌素的生物學(xué)特性和抑菌活性進(jìn)行了研究,旨在為生物機(jī)體調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),食物防腐和醫(yī)藥領(lǐng)域等研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 內(nèi)生細(xì)菌TC-2和TC-3:分離自秦巴山區(qū)野生中國紅豆杉(Taxus chinensisRehd.);抑菌譜所用菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、油菜核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、灰綠青霉(Penicillium glaucum)等,均由作者所在實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,KH2PO45.0 g,MgSO4·7H2O 3.0 g,VB110.0 mg,瓊脂18.0 g,H2O加至1 000 mL。用于菌種保藏斜面、形態(tài)觀察平板、菌種鑒定培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)液:馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g, KH2PO45.0 g,MgSO4·7H2O 3.0 g,VB110.0 mg,(N H4)2SO43.0 g,蛋白胨3.0 g,酵母粉0.8 g,加H2O至1 000 mL。用于菌種發(fā)酵液培養(yǎng);LB (Lusia-Bertani)液體培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)用的酵母提取物(yeast extract)5.0 g,細(xì)菌培養(yǎng)用的胰蛋白胨(bacto peptone)10.0 g,NaCl 10.0 g,H2O至1 000 mL。

1.1.3 試劑 TE緩沖液:Tris-HCl(p H 8.0)10.0 mmol/L,EDTA 1.0 mmol/L;RNase A溶液: RNase A 10.0 mg/mL,Tris-HCl(p H 7.5)10.0 mmol/L;5×TBE緩沖液:Tris 54.0 g,硼酸27.5 g,EDTA 0.01 mmol/L,p H 8.0;6×DNA上樣緩沖液:溴酚藍(lán)0.25%,甘油30.0%;蛋白酶K緩沖液:Tris-HCl(p H 7.5)50.0 mmol/L,CaCl210.0 mmol/L,內(nèi)含50.0μg/mL蛋白酶K;胰蛋白酶緩沖液:Tris-HCl(p H 8.0)50.0 mmol/L,CaCl210.0 mmol/L,內(nèi)含50.0μg/mL胰蛋白酶;胃蛋白酶緩沖液:NaCl 0.2%,HCl(p H 3.0),內(nèi)含50.0μg/mL胃蛋白酶,等。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RV-10, IKA),雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-2102C),低速冷凍離心機(jī)(KDC-2046),超低溫冰箱(MDFU5410,SAN YO),超級恒溫水浴鍋(HH-6),p H計(PHS-3E),PCR儀:Model 680型,BIO-RAD,電泳儀(EPS300),高級研究顯微鏡:E600型,Nikon公司產(chǎn)品,凝膠成像系統(tǒng):UVIDB T208,BIO-RAD),等。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選 將剛采集到的新鮮野生中國紅豆杉樹枝用刀切去損傷及污染嚴(yán)重部位,采用軟毛刷刷洗,在自來水上沖洗1 d,吸水紙吸干后,消毒時用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇漂洗,采用體積分?jǐn)?shù)0.1%～0.2%HgCl2浸5～10 min,或體積分?jǐn)?shù)2%NaClO溶液浸10～15 min,然后以無菌水沖洗2～3次,用無菌濾紙吸干水后,在無菌條件下剝下樹皮并切成小塊,接種于PDA平板上,培養(yǎng)5～7 d,待樹皮周圍產(chǎn)生細(xì)菌菌落時,及時將其挑取于PDA斜面培養(yǎng)并保藏。用CaCO3中和酸法初篩,牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[13]檢測被測菌斑周圍是否形成抑菌圈,來判斷被檢菌能否產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分類鑒定 進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括鞭毛、芽孢)及染色特性進(jìn)行觀察,在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等,在液體培養(yǎng)中的表面生長情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。同時進(jìn)行糖酵解試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、接觸酶反應(yīng)等生理生化試驗進(jìn)一步鑒定。

采用鹽析法提取細(xì)菌總DNA,接種菌落于5.0 mL LB中,30℃培養(yǎng)過夜;取1.0 mL種子培養(yǎng)液接入100 mL 2%LB中,37℃、220 r/min培養(yǎng)16 h;5 000 r/min離心10 min,棄去上清液;加入10 mL TE離心洗滌后,用10.0 mL TE溶解菌體,混勻, -20℃保存?zhèn)溆?取3.5 mL菌懸液,加入184.0μL 10%SDS,混勻,加入37.0μL10.0 mg/mL蛋白酶K,混勻,37℃溫育1h;加入終濃度2.0 mg/mL的溶菌酶,37℃溫育1 h;加入66.0μL 5.0 mol/L NaCl,混勻充分,12 000 r/min 10 min,上清液用粗槍頭取至新管;等體積酚充分混勻,12 000 r/min 3 min,反復(fù)抽提至無蛋白層;取水層,等體積CHCl3混勻,12 000 r/min 3 min;上清液移至新管,2倍體積預(yù)冷無水乙醇,-20℃,20 min,14 000 r/min,15 min;400.0μL 70%冷乙醇洗滌,干燥,100.0μL 20.0μg/mL RNaseA,37℃,30 min;2倍體積無水乙醇沉淀,體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇洗滌,干燥,溶于100.0μL TE。

以細(xì)菌通用引物8F(5′-3′):A GAGTTTGA TCCTGGCTCAG和1492R(5′-3′):GGTTACCTTGTTACGACTT擴(kuò)增TC-2和TC-3的16S rDNA序列。PCR反應(yīng)體系:DNA模板約30.0 ng,10×PCR緩沖液2.0μL,25.0 mmol/L MgCl22.0μL,10.0 mmol/L的8F和1492R各1.0μL, dNTPs(10.0 mmol/L)0.5μL,Taq DNA聚合酶(5.0 U/μL)0.5μL,加滅菌雙蒸水至20.0μL。PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃60 s,50℃80 s, 72℃100 s,35個循環(huán);72℃15 min。用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠于電壓100V水平電泳1h檢測分析PCR產(chǎn)物,純化的PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

將所測序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中并進(jìn)行Blast檢索,下載同源性較高的數(shù)據(jù),生成Fasta格式的文件。用Clusta-X軟件對所得序列進(jìn)行人工校正及比對分析[14]。利用Mega3.1[15]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16],將所測序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中并進(jìn)行Blast檢索,下載同源性較高的數(shù)據(jù),生成Fasta格式的文件。用Clusta-X軟件對所得序列進(jìn)行人工校正及比對分析。利用Mega3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 抑菌活性的研究 取培養(yǎng)過夜的細(xì)菌TC-2和TC-3菌液,以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入500.0 mL的發(fā)酵培養(yǎng)液,在28℃、180 r/min的搖床培養(yǎng)6 d,然后在低速冷凍離心機(jī)以10 000 r/min離心10 min,得發(fā)酵液上清液。將500.0 mL上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮定容至100.0 mL。

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[13],首先排除酸性干擾和過氧化氫干擾,其次以E.coli為指示菌,對其熱穩(wěn)定性、p H穩(wěn)定性、蛋白酶敏感性進(jìn)行研究,最后選用革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、部分真菌作為檢測的指示菌,以確定其抑菌譜。

在抑菌圈平均直徑測定中,每個實驗數(shù)據(jù)平行重復(fù)3次。在熱穩(wěn)定性研究、p H穩(wěn)定性研究中,以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照,活性下降百分率=(對照抑菌圈平均直徑-處理后抑菌圈平均直徑)/對照抑菌圈平均直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選

采用平板稀釋法,從秦巴山區(qū)野生紅豆杉中分離純化得到25株內(nèi)生細(xì)菌。通過牛津杯瓊脂擴(kuò)散法,篩選到兩株抑菌活性較好的菌株,編號為TC-2和TC-3。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分類鑒定

2.2.1 生物學(xué)特性 對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)特征及生理生化性質(zhì)測定表明:TC-2菌體細(xì)胞呈桿型,單個排列,革蘭氏陽性,運動,鞭毛側(cè)生,有芽孢,孢子橢圓,中生;菌落圓形,表面色暗,不透明,起皺,褐色;在培養(yǎng)液中色較暗、皺褶,輕度混濁;發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和葡萄糖酸鈉產(chǎn)酸,發(fā)酵葡萄糖、葡萄糖酸鈉不產(chǎn)氣,接觸酶陽性,淀粉水解陽性,硝酸鹽還原陽性,生長溫度15～45℃。根據(jù)TC-2的形態(tài)生長特征和生理生化特性,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)[17],初步鑒定為芽孢桿菌屬。

TC-3菌體細(xì)胞呈桿型,鏈狀排列,革蘭氏陽性,運動,鞭毛側(cè)生,有芽孢,形成內(nèi)生孢子,孢子橢圓,中生;菌落圓形,表面色淡,不透明,光滑,淡黃色;在培養(yǎng)液中色較暗,輕度混濁;發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和葡萄糖酸鈉產(chǎn)酸,發(fā)酵葡萄糖、葡萄糖酸鈉不產(chǎn)氣,接觸酶陽性,淀粉水解陰性,硝酸鹽還原陰性,生長溫度10～45℃。根據(jù)TC-3的形態(tài)生長特征和生理生化特性,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)[17],初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 對內(nèi)生細(xì)菌菌株TC-2和TC-3的部分16S rDNA基因進(jìn)行測序,所得序列同GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。菌株TC-2(登錄號:GQ461727)同數(shù)據(jù)庫中B acillus subtilis的已知菌株序列同源性均≥99%。在進(jìn)化樹中,該菌株同B.subtilis類聚于同一分支,步長為87,結(jié)合形態(tài)特征菌株TC-2為B.subtilis,TC-2。菌株TC-3(錄號:GQ461728)分別和B acillus屬的不同種的序列同源性≥99%,步長為99,該菌株TC-3初步確定為B acillussp., TC-3。

2.3 抑菌活性的研究

2.3.1 抑菌譜 選用革蘭氏陽性細(xì)菌,革蘭氏陰性細(xì)菌,真菌作為檢測的指示菌,牛津杯法測定各指示菌的抑菌作用,以確定其抑菌譜,見表1。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of the endophytic bacteria,based on 16S rDNA sequences analysis

表1 抑菌譜Tab.1 Antibacterial spectrum

表1表明,TC-3和TC-2產(chǎn)生的活性物質(zhì)對棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的抑菌效果最好,對油菜核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黑曲霉(Aspergillus niger)也有一定的抑菌效果,其次對大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在內(nèi)的常見食源性和人畜共患病的病原菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性。由此, TC-3和TC-2產(chǎn)生的活性物質(zhì)不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用,更重要的是能夠抑制革蘭氏陰性菌,而且對部分真菌也有抑菌作用。

1)酸性末端產(chǎn)物干擾的排除 細(xì)菌TC-3和TC-2發(fā)酵液對指示菌的抑制作用,可能是酸性末端產(chǎn)物如乙酸、乳酸及其他有機(jī)酸作用的結(jié)果。為了排除酸性末端產(chǎn)物的干擾,將培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液離心,取上清液,中和至p H 5.0,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗,以p H 5.0的乳酸和乙酸為對照,重復(fù)3次(見表2)。

表2 排除酸作用的抑菌試驗結(jié)果Tab.2 Results of inhibition test without the effect of organic acid

表2表明,p H值為5.0的乳酸和乙酸均不能抑制指示菌的生長,而p H值為5.0的TC-3和TC-2發(fā)酵上清液對指示菌仍然具有強(qiáng)烈的抑制作用。由此,TC-3和TC-2發(fā)酵液中存在除酸以外的其他抑菌物質(zhì)。

2)發(fā)酵液中過氧化氫的檢測 細(xì)菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫也可能抑制細(xì)菌的生長,尤其是抑制革蘭氏陰性菌的生長,因此必須排除過氧化氫的干擾。取1.0 mL發(fā)酵上清液,加入10.0 mg/mL的過氧化氫酶液1.0 mL,在30℃水浴反應(yīng)60 min,之后,用處理過的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌試驗。以大腸桿菌為指示菌,以未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液為對照,重復(fù)3次。

表3 排除過氧化氫作用的抑菌試驗結(jié)果Tab.3 Results of inhibition test without the effect of hydrogen peroxide

表3表明,經(jīng)過氧化氫酶處理的TC-3和TC-2發(fā)酵液的抑菌作用幾乎沒有變化。由此,TC-3和TC-2發(fā)酵上清液的抑菌作用不是過氧化氫作用的結(jié)果。

2.3.2 代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性分析

1)熱穩(wěn)定性 將TC-3和TC-2發(fā)酵液在不同溫度下保持20 min,以大腸桿菌為指示菌,以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照,做抑菌試驗。

表4表明,隨著處理溫度的不斷升高,TC-3和TC-2發(fā)酵液的抑菌活性不斷下降,但是發(fā)酵液經(jīng)105℃處理20 min后,仍保留有抑菌活性。說明TC-3和TC-2具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3.2 p H穩(wěn)定性 將TC-3和TC-2發(fā)酵液用1.0 mol/L的HCl和2.0 mol/L的NaOH調(diào)至不同的p H(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),然后用牛津杯法,以E.coli為指示菌做抑菌試驗,重復(fù)3次(見表5)。

表4 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Tab.4 Heating stability of the inhibitory substance

表5 抑菌活性物質(zhì)的pH穩(wěn)定性Tab.5 The pHstability of the inhibitory substance

表5表明,TC-3和TC-2的抑菌活性隨著p H的升高而下降,當(dāng)p H為6.0以上時抑菌活性消失。說明TC-3和TC-2在酸性條件下穩(wěn)定,顯示抑菌活性的p H為3.5～5.5。

3)蛋白酶敏感性 各取TC-3和TC-2的3份等量(1.0 mL)的發(fā)酵上清液,用1.0 mol/L的HCl和2.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)p H為胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶作用的最適p H值(分別為7.6, 7.6,2.0),按1.0 mg/mL加入各酶解液,在37℃下預(yù)溫1 h,再將p H調(diào)回類細(xì)菌素的最適p H,以E-.coli為指示菌做抑菌試驗,重復(fù)3次,并設(shè)對照(見表6)。

表6 抑菌活性物質(zhì)的蛋白酶敏感性Tab.6 Sensitivity to proteinases of the inhibitory substance

表6表明,經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶處理后,TC-3和TC-2抑菌圈直徑略有減少,但仍具有很明顯的抑菌作用,從而表明了該活性物質(zhì)為非蛋白組分,或者起抑菌作用的不是單一的物質(zhì),關(guān)于其具體成分還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

自Strobel等[6]從短葉紅豆杉中分離得到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來,紅豆杉內(nèi)生菌的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的一個熱點,許多內(nèi)生真菌相繼被分離得到。目前,國內(nèi)有關(guān)紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌的研究報道較少。本研究從中國紅豆杉莖中分離得到內(nèi)生細(xì)菌TC-3、TC-2,生物學(xué)特性和16S rDNA序列分析表明分別屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌。

細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫以及細(xì)菌素或者抗生素類物質(zhì)都具有抑菌活性。為了排除這些非類細(xì)菌素的抑菌作用,通過對照試驗證明了發(fā)酵液中存在有除有機(jī)酸和過氧化氫以外的其他活性物質(zhì)。該活性物質(zhì)具有耐高溫,在酸性條件下穩(wěn)定且活性高,對蛋白酶敏感性低,且對G-菌有明顯的抑制作用,這些特征與一般細(xì)菌素的特性明顯不同,而與已報道的類細(xì)菌素相近。Talarico等[18]報道1株乳酸菌能夠產(chǎn)生一種非細(xì)菌素的廣譜抑菌物質(zhì),該物質(zhì)對G+菌及G-菌、真菌都具有明顯的抑制作用。Coconnier等[19]發(fā)現(xiàn)一種對熱穩(wěn)定、對蛋白酶敏感性低、低相對分子質(zhì)量、對G+菌及G-菌都具有抑菌活性的抑菌活性物質(zhì),且在酸性條件下活性更高。類細(xì)菌素物質(zhì)性質(zhì)各異,結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜。根據(jù)此研究活性物質(zhì)的性質(zhì),初步判斷為非蛋白組分,或起抑菌作用的不是單一物質(zhì),有關(guān)分離純化發(fā)酵液中的主要成分及其性質(zhì)的進(jìn)一步研究、該代謝產(chǎn)物抑菌活性與紅豆杉中紫杉醇的抗癌療效的關(guān)系正在進(jìn)行之中。

植物內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物在長期協(xié)同進(jìn)化過程中,對宿主植物具有許多生物學(xué)作用,如促進(jìn)植物對惡劣環(huán)境的適應(yīng),拮抗環(huán)境中病原微生物的侵襲等[7]。本研究的類細(xì)菌素具有較寬的抑菌譜,能夠一直包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在內(nèi)的常見食源性和人畜共患病的病原菌。因此,在生物機(jī)體調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、食物防腐和醫(yī)藥領(lǐng)域等具有一定的應(yīng)用潛力。

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典(修訂版)[M].北京:科學(xué)出版社,1982.481.

[2]中國科學(xué)院植物研究所編輯委員會.中國植物志第七卷[M].北京:科學(xué)出版社,1978.438-443.

[3]Wani M C,Taylor H I,Wall M E,et al.Plant antitumor agents VI:the isolation and structure of taxol,a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J].Am Chem Soc,1971,93(9):23-25.

[4]Schiff P B,Fant J,Horwitz SB.Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol[J].Nature,1979,277:665-667.

[5]梅興國,魯明波.紫杉醇的抗癌作用及治療其它疾病的潛力[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊,1996,23(3):136-140.

MEI Xing-guo,LU Ming-bo.Anti-cancer effect of taxol and the potential for treatment of other diseases[J].Foreign Medical Sciences Section On Pharmacy,1996,23(3):136-140.(in Chinese)

[6]Strobel G A,Stierle A,Stierle D,et al.Taxomyces andreanae,a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete assotiated with Pacific yew[J].Mycotaxon,1993,XL(VII):71-78.

[7]李強(qiáng),劉軍,周東坡,等.植物內(nèi)生菌的開發(fā)與研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2006,3:33-37.

LI Qiang,LIU Jun,ZHOU Dong-po,et al.Advance on exploitation and research of endophyte[J].Biotechnology Bulletin,2006,3:33-37.(in Chinese)

[8]周東坡,平文祥,孫劍秋,等.紫杉醇產(chǎn)生菌分離的研究[J].微生物學(xué)雜志,2001,21(1):18-20. ZHOU Dong-po,PING Wen-xiang,SUN Jian-qiu,et al.Separation of Taxol-producing bacteria[J].Journal of Microbiology,2001,21(1):18-20.(in Chinese)

[9]Virginia S O,Aida A P,Maria E N.Characterization of a bacterioncin-like substance produced by a vaginal Lactobacillus salivarius strain[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(5):5631-5635.

[10]Whitford M F,Mc Pherson M A,Forster R J.Idengtification of bacteriocin-like inhibitors from rumen Streptococcus spp.And isolation and characterization of bovicin 255[J].Appl Environ Microbiol,2001,67(2):569-574.

[11]Renate P Schobitz,Pamela A Borquez.Bacteriocin-like substance production by Carnobacterium piscicola in a continuous system with three culture broths study of antagonism against Listeria monocytogenes on vacuum packaged salmon[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2006,37(1):52-57.

[12]Konisky J.Colicins and other bacteriocins with established modes of action[J].Annu Rev Microbiol,1982,36:125-144.

[13]Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997,24:4876-4882.

[14]Kumar S,Tamura K,Nei M.MEGA3:integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J].Brief Bioinform,2004,5:150-163.

[15]Saitou N,Nei M.The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol, 1987,4:406-425.

[16]Casla D,Requena T,Gomez R.Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from goats,milk and artisanal cheeses:characteristics of a bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus IFPL105[J].Appl Bacteriology,1996,81(1):35 -41.

[17]Sicanan RE,Gibbs N E.Berger Manual Determinative Bacteriology(9th edition)[M].Beijing:Science Press,1997.741 -770.

[18]Talarico T L,Dobrogosz W J.Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri [J].Antimicrob Agents Chemother,1989,33(5):647-679.

[19]Coconnier M H,Lievin V,Bernet Camard M F,et al.Antibacterial effect of the adhering human Lactobacillus acidophilus strain LB[J].Antimicrob Agents Chemother,1997,41(5):1046-1052.

(責(zé)任編輯:楊萌)

Antibacterial Activities of Metabolites Produced by Two Endophytic Bacteria Isolates in Taxus Chinensis

ZHAO Yun-xin1, LIU Kai-hui1,2, DENG Bai-wan＊1,2, CHEN Wen-qiang1,2,
GENG Zhi1, LI Juan-hua1
(1.School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China;
2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi,Hanzhong 723001,China)

In this study,two strains,TC-3 and TC-2,identified asB acillus sp.andB acillus subtilisbased on the biological characteristics and 16S rDNA sequence analysis,was screened from 25 isolates of endophytic bacteria from wildTaxus chinensisin Qinba Mountain.Those strain exhibited the ability in producing inhibitory activity substance,Without the effect of organic acid and hydrogen peroxide,supernatant of the liquid culture of TC-3 and TC-2 showed significant inhibitory activity against gram-positive bacteria,including Staphylococcus aureus,B acillus subtilisand gram-negative bacteria such asEscherichia coli.Inhibition of some kind of epiphyte was also found.After treatment with trypsin,pepsin and proteinase K,the culture’s inhibitory activitydecreasedslightly,thisshowedthatitisnon-protein ingredients orantibacterial effect of the non-single material.This indicated it belongs to a kind of bacteriocinlike substance.The inhibitory substance,showed good heating stability,high activity at low p H,low sensitivity to proteinases and a broad antibacterial spectrum.

taxus chinensis,endophytic bacteria,antibacterial,active substance

Q 939.92

:A

1673-1689(2010)04-0617-07

2009-04-25

陜西省重點實驗室資助項目(No.08JZ21);陜西省教育廳科研基金項目(No.08J K248,No.08J K244);陜西理工學(xué)院科研基金項目(No.SLJQD0712,No.SLJQD0713)。

＊通信作者:鄧百萬(1963-),男,陜西漢中人,教授,主要從事微生物學(xué)研究。Email:Dengbw2008@yahoo.com.cn