高效液相色譜法測定復方甘草酸苷分散片中甘氨酸與蛋氨酸的含量

徐先知 肖愛平 劉海燕 周志剛

湖南省長沙市湖南華納大藥廠有限公司，湖南 長沙 410331

復方甘草酸苷分散片是以復方甘草甜素片為原劑型開發的新劑型，它在1948年于日本上市，商品名為美能?，我國于20世紀80年代開始在臨床上應用，用于治療慢性肝病，改善肝功能異常、濕疹，皮膚炎，斑禿。本品組分為甘草酸單銨鹽S（以甘草酸計）、甘氨酸和DL-蛋氨酸，但由于甘氨酸與蛋氨酸的均無紫外吸收，故復方甘草甜素片（標準JX20000079）中甘氨酸和蛋氨酸的含量測定方法分別為薄層掃描法和滴定法：前者重復性不好，誤差大，后者終點難以判斷。本文經試驗研究采用通過2，4-二硝基氟苯柱前衍生，建立HPLC法測定甘氨酸和蛋氨酸含量的方法，該方法準確、簡便，能很好的控制復方甘草酸苷分散片的質量。

1 儀器和試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀（島津），SPD-10A紫外檢測器（島津）；UV2450型紫外分光光度計（島津）；甘氨酸、蛋氨酸對照品（中國藥品生物制品檢驗所，批號：140689-200401、140684-200401）；乙腈為色譜純試劑；復方甘草酸苷分散片（湖南華納大藥廠有限公司，批號：090805、090807、090809，規格：每片含甘草酸單銨鹽S（以甘草酸計）25mg、甘氨酸25mg、DL-蛋氨酸25mg。

2 方法結果

2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特Hypersil C18柱（4.6mm×200mm），粒度5μm；檢測器：SPD-10A紫外檢測器；流動相為：0.025mol·L-1醋酸鈉溶液（用醋酸調節pH值至6.0）-甲醇-乙腈（60∶30∶10）；檢測波長：360nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取甘氨酸與蛋氨酸對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1ml中約含甘氨酸與蛋氨酸都為0.25mg的混合溶液，精密量取該溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加0.05mo l·L-1碳酸氫鈉溶液（pH9.0）1.0ml及0.8% 2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液1.0ml，置50℃水浴中暗處反應60分鐘，取出，放冷，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至刻度，放置20分鐘，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，取約0.27g，精密稱定（約相當于甘氨酸與蛋氨酸各25mg），置100ml量瓶中，加水適量，超聲處理20分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，照“2.2.2”項下的“精密量取該溶液1.0ml”起同法制備得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方規定的配比，制成不含甘氨酸和DL-蛋氨酸的樣品，照“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 測定法 精密量取上述各溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積分別計算甘氨酸和蛋氨酸的含量，即得。

2.3 檢測波長的確定

精密吸取上述三種溶液各1ml，分別置25ml棕色量瓶中加流動相稀釋至刻度，分別照紫外-可見分光光度法（中國藥典2005年版二部附錄ⅣA）在190～400nm波長范圍內掃描。結果甘氨酸、蛋氨酸和復方甘草酸苷分散片溶液均在360nm波長處有最大吸收，故選360nm作為本品的檢測波長，且空白輔料無干擾。

2.4 專屬性試驗

精密吸取上述三種溶液各10μl注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，結果甘氨酸、蛋氨酸與其前面相鄰峰分離度R大于1.5（見圖1）。

圖1 復方甘草酸苷分散片溶液(C)HPLC圖

2.5 陰性干擾試驗

精密量取陰性樣品溶液10μl，注入液相色譜儀中，依法測定，記錄色譜圖。結果空白輔料無干擾（見圖2）。

圖2 空白輔料溶液HPLC圖

2.6 線性相關性試驗

分別精密稱取甘氨酸與蛋氨酸對照品適量，置100ml量瓶中，從加水適量起同“2.2.2”項下同法制得甘氨酸與蛋氨酸濃度都約為10、15、20、25、30、38ug·ml-1的對照品混合溶液。分別精密量取上述溶液10μl，注入液相色譜儀中，依法測定其峰面積。以甘氨酸和蛋氨酸濃度（ug·ml-1）為橫坐標，甘氨酸和蛋氨酸峰面積（A）為縱坐標分別繪制標準曲線，分別得回歸方程Y=80703X+2532.1，r=0.9994；Y=41810X+879.69，r=0.9996。結果表明，甘氨酸和蛋氨酸濃度分別在10.58～39.68ug·ml-1、10.44～39.15ug·ml-1與峰面積線性關系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，甘氨酸和蛋氨酸的平均峰面積分別為1737015、879061，RSD分別為0.20%、0.20%，表明精密度良好。

2.8 重復性試驗

取同一批號（批號：090805）的樣品6份，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件平行測定，計算含量。甘氨酸和蛋氨酸含量分別為98.9%、99.2%，RSD分別為0.6%、0.7%。表明重復性良好。

2.9 穩定性考察試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液分別在配制后0、0.5、1、2、4小時，精密量取10μl注入液相色譜儀，測定峰面積，甘氨酸和蛋氨酸的RSD分別為0.1%、0.4%。表明樣品溶液在4小時內穩定性良好。

表1 復方甘草酸苷分散片中甘氨酸回收率測定結果

2.10 加樣回收試驗

取供試品（批號：090805，含量：甘氨酸含量77.0mg·g-1、蛋氨酸含量77.2mg·g-1）20片，研細，取約0.1～0.2g（按高、中、低三種濃度，各平行三份，共9份），精密稱定，分別精密加入甘氨酸與蛋氨酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定含量，結果見表1～2。

2.11 樣品測定

取三批復方甘草酸苷分散片的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣10μl，測定峰面積，以外標法分別計算甘氨酸和蛋氨酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(n=5)

3 討論

3.1 衍生反應比例的考察

筆者通過平行設計試驗進行比較，當氨基酸與2，4-二硝基氟苯摩爾比在1∶5～1∶10之間時兩種氨基酸的峰面積均不再增加，為了減少其它副反應，確定本品衍生時的摩爾比為1∶5。

3.2 衍生反應溫度的考察

溫度是該衍生化反應的重要指標，當溫度在50℃、60℃都能滿足本品含量測定的要求，同時參照文獻報道，確定該衍生反應溫度為50℃。

3.3 衍生反應時間的考察

筆者通過平行設計了四個時間進行試驗，結果該反應經過1小時后已定量反應完全，同時參照文獻報道，確定該衍生反應時間為60分鐘。

[1]進口標準[S].JX20000079：復方甘草甜素片質量標準.

[2]國家標準[S].WS-10001-（HD-1269）-2002：甘草酸單銨鹽鹽S質量標準.

[3]陳婭蘭，付宜和.十八種氨基酸注射液的HPLC 2，4-二硝基氟苯柱前衍生化法含量測定[J].藥物分析雜質，1990；10（8）：149～150.

[4]國家藥品標準手冊.國家藥典委員編.第三版.