基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)5A/6A基因多態性與多發性硬化相關性研究

李傳斌, 盧 宏, 張深義, 趙偉麗

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種病因未明的中樞神經系統自身免疫性脫髓鞘疾病。流行病學調查結果提示,遺傳因素可能在 MS發病機制中起作用。基質金屬蛋白酶在中樞神經系統(CNS)疾病的炎癥反應中有很強的破壞作用,通過攻擊腦血管的基底膜和破壞血-腦屏障(BBB),導致腦實質的損傷,并對神經元有不同程度的毒性作用。基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)啟動子 5A/6A基因具有多態性[1],檢測這種多態性對某些疾病的遺傳易感性及免疫調控的研究有重要意義。為了解 MMP-3啟動子基因 5A/6A多態性與 MS相關性的關系,本研究用聚合酶鏈式反應(PCR)-連接酶檢測反應(LDR)的基因分型技術檢測了 51例 MS患者及 55例正常人 MMP-3啟動子 5A/6A基因的基因型和等位基因頻率,以探討這些基因與河南省人群中 MS遺傳易感性的可能關系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 研究對象均為河南地區漢族人,飲食結構相似,各研究對象之間無血緣關系。所有研究對象均除外糖尿病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、接受器官移植、嚴重營養不良等疾病。全部受試對象均取得知情同意。MS組:共 51例,為 2002年 5月 ～2007年 11月間在鄭州大學第一附屬醫院神經內科住院的或出院后定期門診隨訪的臨床確診或實驗室支持確診的 MS患者,診斷均符合 poser標準。其中男性 19例,女性 32例,年齡14～69歲,平均 39.05±14.31歲,均經 2名以上神經內科專家診斷,符合 Poser等制定的臨床確診(definite)或實驗室支持確診的 MS診斷標準。分型情況:復發緩解型 39例,進展復發型 1例,原發進展型 2例,實驗室支持確診 9例(包括視神經脊髓炎 3例)。其中活動期患者 33例,穩定期患者 18例。對照組:55例,男性 29例,女性 26例,年齡 20～56歲,平均 34.31±10.71歲,均為河南漢族人,由河南省紅十字會獻血中心的健康獻血者中隨機抽取。兩組間性別、年齡差異無顯著意義。

1.1.2 實驗材料 PCR引物序列合成:上海翼和應用生物技術有限公司根據生物軟件 oligo6.0設計;Taq酶體系(酶 5U/μl,德國 Qiagen公司);dNTP(2mM/each美國 RKOMEGA公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本基因組 DNA的提取 采用酚氯仿法,從外周靜脈全血中提取人全基因組 DNA。(1)采血:采取每例患者和正常對照組外周靜脈全血3ml加入 EDTA抗凝管中,立即放入 -20℃冰箱中冷凍保存;(2)編號;(3)取 600μlEDTA抗凝全血加入1ml EP管中;(4)取紅細胞(RBC)裂解液(德國 BAG公司)900μl,加入 EP管中蓋好上蓋,分別搖動 30～40次;(5)放入離心機 6000r/min離心 45s,棄去上清;(6)再次加入紅細胞裂解液 600μl加入 1ml EP管中,蓋好蓋子,分別搖動 30～40次;(7)放入離心機 6000r/min離心 45s,棄去上清;(8)加入白細胞(WBC)裂解液 400μl,蓋好上蓋,放在振蕩器上振蕩均勻;(9)打開上蓋,加入冰凍無水乙醇 1000μl,蓋好上蓋,輕輕顛倒均勻,可見絮狀 DNA沉淀;(10)吸取絮狀 DNA加入到另一標好相應編號的 1ml EP管中;(11)加入 75%乙醇 1000μl蓋好上蓋搖動幾次;(12)放入離心機中 6000r/miin離心 2min,打開上蓋,輕輕棄去上清,打開上蓋在吸紙上輕叩吸去殘留的乙醇;加入 400μl蒸餾水,輕輕彈動使沉淀的 DNA充分溶解,抽樣紫外分光光度法測定 DNA濃度為0.14μg/ml;(13)放入 4℃冰箱中過夜保存備用。

1.2.2 MMP-3啟動子 5A/6A基因檢測 上游引物序列為 5'-ACATGGGTCACGGCACCT-3',下游引物序列為 5'-GTGGCCAAATATTTTCCCTGT-3';PCR體系總體積為 20μl,其中包括 DNA模板 1μl,2mmol/LdNTP 2μl,1 ×PCR緩沖液 2μl,上、下游引物各 0.2μmol/L,1u/ul TaqDNA聚合酶 0.2ul。PCR反應條件為 95℃預變性 15min,然后于 94℃ 30s、56℃ 60s、72℃ 60s,共 35個循環,再于 72℃延伸7min。PCR擴增后用 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有特異性的擴增產物。

1.2.3 連接酶檢測反應(LDR)及測序儀電泳對人全基因組 DNA模板獲得的 PCR擴增產物進行多重 LDR(Multiplex LDR),最后通過測序儀電泳讀取檢測結果。

1.3 統計學處理 計算出正常人群中 MMP-3啟動子 5A/6A等位基因的頻率,然后進行 Hardy-Weinber遺傳平衡定律檢驗,以 α=0.05作為檢驗水準。對不同樣本間 MMP-3啟動子 5A/6A基因各亞型頻率和等位基因頻率采用配對資料的 RxC列聯表進行檢驗,以 α=0.05作為檢驗水準。

2 結 果

2.1 MMP-3啟動子 5A/6A等位基因的測定標本經 PCR/多重 LDR反應及測序儀電泳后應用Genemapper進行數據分析可分出 3種基因型:MMP-3 5A/5A型(數據分析圖上于 125處出現 1個波峰,5A等位基因純合子);MMP-3 5A/6A型(數據分析圖上于 125、126處出現 2個波峰,雜合子);MMP-3 6A/6A型(數據分析圖上于 126處出現 1個波峰,6A等位基因純合子)(見圖1)。

圖1 應用 Genemapper進行數據分析,MMP-3(5A/6A)基因的分型截圖,在 MMP-3(5A/6A)基因位點存在多態性:即有 5A/5A和6A/6A純合子;也存在 5A/6A雜合子

2.2 MMP-3啟動子 5A/6A基因型頻率和遺傳平衡間的符合程度測定 進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示對照組和病例組 MMP-3啟動子 5A/6A基因型頻率分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P=0.63,P=0.26)。2.3 MMP-3啟動子 5A/6A基因型和等位基因頻率分布比較 對照組及 MS組MMP-3(5A/6A)基因型分布(見表1),兩組比較無統計學意義(χ2=2.12,P=0.35);對照組和 MS組MMP-3(5A/6A)等位基因頻率(見表2),兩組比較無統計學意義(χ2=0.39,P=0.53)。

表1 對照組及 MS組 MMP-3(5A/6A)基因型比較

表2 對照組和 MS組 MMP-3(5A/6A)等位基因頻率比較

3 討 論

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經系統炎性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病,發病機制尚不明確。其炎性反應過程顯示炎癥細胞是在包括黏附分子和細胞因子在內所致的炎癥級聯反應通過細胞聚集和滲出進入大腦組織的[2],多發性硬化患者中樞神經系統病變的炎癥機制使人們認識到對破壞組織的蛋白酶和調節因子應進行更多的研究[3]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一類 Zn2+依賴的中性蛋白酶,與分離整和素金屬蛋白酶(ADAMs)、分離整和素金屬蛋白酶血栓收縮蛋白(ADATMs)共同組成金屬蛋白酶(MPs)超家族。基質金屬蛋白酶(MMPs)對破壞血腦屏障、炎癥反應細胞進入中樞神經系統均起到重要的作用,在體外實驗中還發現能降解髓磷脂和髓鞘堿性蛋白[4]。基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)能降解包括纖維結合蛋白、層粘連蛋白及 IV型膠原蛋白在內的多種細胞外基質成分,而這些成分被認為是血腦屏障(BBB)基本結構和功能成分[5]。MMP-3基因位于11q22,在 Ye S等[1]的研究中已經證實人 MMP-3啟動子區域 5A/6A基因普遍存在多態性。多態性會使 MMP-3基因的轉錄活性發生改變,從而影響體內MMP-3水平。在 Ye S等[6]人的研究中顯示體外培養的細胞中含 MMP-35A等位基因有著更強的啟動子轉錄活性。在 Medley等[7]人的研究中發現在大動脈血管疾病中 MMP-35A/5A基因型的患者在血管壁中 MMP-3的表達和 mRNA的轉錄水平與雜合子基因型(5A/6A)相比是增高的,而基因型為 6A/6A的 MMP-3的表達和 mRNA的轉錄水平與之比較則是降低的。Maeda等[8]的研究中發現在多發性硬化患者的病灶中 MMP-3的表達水平增高,在 Kouwenhoven等[9]的研究中應用原位雜交技術檢測多發性硬化患者外周血單核細胞發現 MMP-3的 mRNA轉錄水平增高。在 Kanesaka等[10]的研究中發現復發-緩解型多發性硬化患者中,血清 MMP-3水平顯示有連續性的變化,在復發期較緩解期有明顯的增高,且多在 1m內恢復至緩解期的水平。而且在 Tamara等[11]人的研究中發現 MMP-3(5A/6A)基因多態性與多發性硬化疾病嚴重程度相關。這些研究提示 MMP-3在多發性硬化疾病中起著重要的作用,降低 MMP-3水平或調節 MMP-3基因轉錄活性也許會對緩解多發性硬化患者的病情起到有益的作用。

在我們的研究中未發現 MS患者 MMP-3(5A/6A)基因各基因型和等位基因頻率與正常對照組有顯著性差異(P均大于 0.05),提示 MMP-3(5A/6A)基因多態性與 MS的易感性不相關。這與 Tamara等[11]人所研究的結果類似。但在進行更深一步的研究之前,我們仍不能忽略 MMP-3(5A/6A)基因遺傳多態性與多發性硬化易感性之間的聯系。在我們看來 MMP-3(5A/6A)基因的遺傳多態性可能與多發性硬化的發病無關,其原因可能是 MS是一種多基因遺傳病,MS的遺傳易感性可能是由多種基因決定的,其發病依賴于多個基因獨立的或累積的效應;不同人群的患者其易感基因也可能是不同的。環境因素在 MS的發病中也有著不可忽略的作用。另外,本研究所涉及的病例較少以及病例-對照研究產生的偏移也會影響研究結果。

[1] Ye S,Watts GF,Mandalia S,et al.Preliminary report:Genetic variation in the human stromelysin promoter is associated with progression of coronary atherosclerosis[J].Br Heart J,1995,73:209-215.

[2] Piccio L,Rossi B,Scarpini E,et al.Molecular mechanisms involved in lymphocyterecruitment in inflamed brain microvessels:critical roles for P-selectin glycoproteinligand-1 and heterotrimeric G(i)-linked receptors[J].J Immunol,2002,168:1940-1949.

[3] Chandler S,Miller KM,Clements JM,et al.Matrix metalloproteinases,tumor necrosis factor and multiplesclerosis:an overview[J].J Neuroimmunol,1997,72:155-161.

[4] Chandler S,Coates R,Gearing A,et al.Matrix metalloproteinases degrade myelin basic protein[J].Neurosci Lett,1995,201:223-226.

[5] Mun-Bryce S,Lukes A,Wallace J,et al.Rosenberg GA Stromelysin-1 and gelatinase A are upregulated before TNF-alpha in LPS-stimulated neuroinflammation[J].Brain Res,2002,933:42-49.

[6] Ye S,Erikson P,Hamsten A,et al.Progression of coronary atherosclerosis is associated with common genetic variant of the human stromelysin-1 promoter which results in reduced gene expression[J].J Biol Chem,1996,271:13055-13060.

[7] Medley TL,Kingwell BA,Gatzka CD,et al.Matrix metalloproteinase-3 genotype contributesto age-related aortic stiffening through modulation of gene and protein expression[J].Circ Res,2003,92:1254-1261.

[8] Maeda A,Sobel RA.Matrix metalloproteinases in the normal human central nervous system,microglial nodules,and multiple sclerosis lesions[J].J Neuropathol Exp Neurol,1996,55:300-309.

[9] Kouwenhoven M,Ozenci V,Gomes A,et al.Multiple sclerosis:elevated expression of matrix metalloproteinases in blood monocytes[J].J Autoimmun,2001,16:463-470.

[10] Kanesaka T,Mori M,Hattori T,et al.Serum matrix metalloproteinase-3levels correlate with disease activity in relapsing-remitting multiple sclerosis[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2006,77:185-188.

[11] Djuric T,Zivkovi M,Stankovi A,et al.Association of the MMP-3 5A/6A gene polymorphism with multiple sclerosis in patients from Serbia[J].JNeurol Sci,2008,267:62-65.