血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)與痰抗酸染色實(shí)驗(yàn)室分析

朱同華

(江蘇省吳江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 吳江 215200)

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病發(fā)病率近年來有所回升，嚴(yán)重危害人類的健康，已成為全球性重大的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題，我國是全球22個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病的患病人數(shù)在世界居第二位。因此結(jié)核病的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)對(duì)該病的預(yù)防和治療有極其重要的意義[1]。經(jīng)典的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法為痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法，進(jìn)行顯微鏡下形態(tài)學(xué)檢查，但該方法存在操作繁瑣、靈敏度較低、受檢測(cè)者主觀因素影響及實(shí)驗(yàn)室交叉污染風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)，近年來國內(nèi)外相繼報(bào)導(dǎo)了脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、結(jié)核菌重組蛋白抗原16KD和38KD等在結(jié)核桿菌抗體檢測(cè)中的作用[2-3]，本實(shí)驗(yàn)采用南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司提供的蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測(cè)試劑盒，探討蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值，并與痰抗酸染色法涂片鏡檢進(jìn)行方法學(xué)比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象 肺結(jié)核患者均為2008年6月到2009年12月在我院住院接受治療的確診患者共計(jì)88例，正常人86例為體檢健康的某單位職工，均經(jīng)胸X拍片檢查，無結(jié)核病史。

1.2 標(biāo)本的采集與處理 標(biāo)本的采集與處理均按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行操作，血清標(biāo)本為清晨空腹采集靜脈血，分離血清備用。痰液標(biāo)本采用自然咳痰法采集清晨溫開水漱口后的晨痰。

1.3 儀器與試劑 儀器為由南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的PBT-X2型生物識(shí)別儀、試劑為由南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測(cè)試劑盒。痰抗酸染色試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)操作步驟及結(jié)果判斷：結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)操作步驟嚴(yán)格按南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌lgG抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后30min內(nèi)將蛋白檢測(cè)芯片放入PBT-X2型生物識(shí)別儀進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果根據(jù)南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的芯片閱讀儀設(shè)置參數(shù)自動(dòng)判別后，直接打印結(jié)果報(bào)告。

該結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)試劑盒采用基因工程表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種結(jié)核菌復(fù)合群特異性的抗原來檢測(cè)待檢血清中的抗體，如果三者之中任一抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，結(jié)果可判定為陽性。三種抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果可判定為陰性。

2.2 痰涂片鏡檢 操作方法參見 《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用χ2檢驗(yàn)

3 結(jié)果

血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)與痰抗酸染色的結(jié)果見表1。

表1 兩種檢測(cè)方法對(duì)174例各類標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片檢測(cè)靈敏度為83.0%，特異度96.5%，陽性預(yù)期值96.1%，陰性預(yù)期值84.7%。

4 討論

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病，其發(fā)病率近年來有所回升，嚴(yán)重危害人體的健康，結(jié)核病的早期診斷對(duì)患者的治療及預(yù)后非常重要，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法很多，如經(jīng)典的痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核菌分離培養(yǎng)及近年來發(fā)展起來的免疫學(xué)診斷方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(DIGFA)、免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)(DICA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，基因工程重組結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖LAM三種抗原均為結(jié)核分枝桿菌特異性較高的抗原，存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，具有較強(qiáng)的免疫原性，適用于血清學(xué)診斷。一般的免疫學(xué)診斷方法大都采用上述抗原之一，南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司蛋白芯片技術(shù)同時(shí)采用上述三種抗原進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)的陽性率。蛋白芯片的原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核分枝桿菌16KD蛋白和結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種抗原固定在同一膜片上，使抗原抗體反應(yīng)在微孔濾膜上快速進(jìn)行，以膠體金為標(biāo)記物在膜上直接顯色，通過芯片閱讀儀和特定的軟件進(jìn)行結(jié)果分析和判定，從而實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、多通量的檢測(cè)。

早期快速診斷對(duì)結(jié)核病鑒定是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本研究對(duì)蛋白芯片檢測(cè)血清結(jié)核抗體與痰涂片鏡檢結(jié)核菌結(jié)果對(duì)比，由表1可以看出，臨床實(shí)驗(yàn)及方法學(xué)比較顯示，對(duì)結(jié)核病人的診斷中，蛋白芯片法檢測(cè)血清結(jié)核抗體與痰涂片鏡檢陽性率具有顯著性差異。χ2=39.56 P＜0.05，蛋白芯片法的敏感度為83.0%，特異性為96.5%，結(jié)核抗體三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可提高痰涂片陰性者的檢出率，同時(shí)具有簡(jiǎn)便、快捷和受主觀因素影響較低的優(yōu)點(diǎn)。但該方法的局限性在于使用血清樣本的測(cè)定和對(duì)免疫力極度低下者可能無法檢出及其它分枝桿菌的交叉反應(yīng)等。在痰液檢查中，痰涂片、抗酸桿菌鏡檢是我國目前應(yīng)用最為廣泛的方法，它具有設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合各級(jí)醫(yī)療單位應(yīng)用，但其敏感性低及操作者的個(gè)體差異對(duì)結(jié)果影響較大也是其比較大的缺點(diǎn)。故血清結(jié)核抗體蛋白芯片檢測(cè)是結(jié)核病輔助診斷的好方法，值得推廣。

[1]汪謀岳.中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分學(xué)會(huì)2002年學(xué)術(shù)會(huì)議簡(jiǎn)介[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26(2):115-116.

[2]吳玉平,趙月娟,王永明,等.血清抗脂阿拉伯甘露聚糖抗體對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷價(jià)值[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2000,12(6):344-345.

[3]張小剛,莊玉輝,何秀云,等.重組結(jié)核分枝桿菌38KD和16KD蛋白用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值[J].中國防癆雜志,2001,23(5):281-283.

[4]中國防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):18-31.