血清結核抗體蛋白芯片檢測與痰抗酸染色實驗室分析

朱同華

(江蘇省吳江市第一人民醫院檢驗科，江蘇 吳江 215200)

由結核分枝桿菌引起的結核病發病率近年來有所回升，嚴重危害人類的健康，已成為全球性重大的公共衛生問題和社會問題，我國是全球22個高負擔國家之一，結核病的患病人數在世界居第二位。因此結核病的早期診斷、早期發現對該病的預防和治療有極其重要的意義[1]。經典的結核病實驗室診斷方法為痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法，進行顯微鏡下形態學檢查，但該方法存在操作繁瑣、靈敏度較低、受檢測者主觀因素影響及實驗室交叉污染風險高等缺點，近年來國內外相繼報導了脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、結核菌重組蛋白抗原16KD和38KD等在結核桿菌抗體檢測中的作用[2-3]，本實驗采用南京大淵生物技術工程有限責任公司提供的蛋白芯片閱讀儀及結核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒，探討蛋白芯片技術檢測結核分枝桿菌抗體的臨床應用價值，并與痰抗酸染色法涂片鏡檢進行方法學比較，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 肺結核患者均為2008年6月到2009年12月在我院住院接受治療的確診患者共計88例，正常人86例為體檢健康的某單位職工，均經胸X拍片檢查，無結核病史。

1.2 標本的采集與處理 標本的采集與處理均按《全國臨床檢驗操作規程》第3版進行操作，血清標本為清晨空腹采集靜脈血，分離血清備用。痰液標本采用自然咳痰法采集清晨溫開水漱口后的晨痰。

1.3 儀器與試劑 儀器為由南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的PBT-X2型生物識別儀、試劑為由南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的結核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒。痰抗酸染色試劑由珠海貝索生物技術有限公司產品。

2 方法

2.1 結核抗體蛋白芯片檢測操作步驟及結果判斷：結核抗體蛋白芯片檢測操作步驟嚴格按南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的結核分枝桿菌lgG抗體檢測試劑盒說明書進行，反應結束后30min內將蛋白檢測芯片放入PBT-X2型生物識別儀進行結果分析，結果根據南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的芯片閱讀儀設置參數自動判別后，直接打印結果報告。

該結核抗體蛋白芯片檢測試劑盒采用基因工程表達的結核分枝桿菌16KD蛋白和結核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種結核菌復合群特異性的抗原來檢測待檢血清中的抗體，如果三者之中任一抗體檢測結果為陽性，結果可判定為陽性。三種抗體檢測結果均為陰性，結果可判定為陰性。

2.2 痰涂片鏡檢 操作方法參見 《結核病診斷細菌學檢驗規程》[4]。

2.3 統計學處理 采用χ2檢驗

3 結果

血清結核抗體蛋白芯片檢測與痰抗酸染色的結果見表1。

表1 兩種檢測方法對174例各類標本的檢測結果

結核分枝桿菌蛋白芯片檢測靈敏度為83.0%，特異度96.5%，陽性預期值96.1%，陰性預期值84.7%。

4 討論

由結核分枝桿菌引起的結核病，其發病率近年來有所回升，嚴重危害人體的健康，結核病的早期診斷對患者的治療及預后非常重要，結核病的實驗室診斷方法很多，如經典的痰Ziehl-Neelsen抗酸染色法、結核菌素試驗、結核菌分離培養及近年來發展起來的免疫學診斷方法如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、斑點免疫滲濾試驗(DIGFA)、免疫印跡試驗(Western blot)、斑點免疫層析試驗(DICA)和聚合酶鏈式反應等，基因工程重組結核分枝桿菌16KD蛋白和結核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖LAM三種抗原均為結核分枝桿菌特異性較高的抗原，存在于結核分枝桿菌復合群中，具有較強的免疫原性，適用于血清學診斷。一般的免疫學診斷方法大都采用上述抗原之一，南京大淵生物技術工程有限責任公司蛋白芯片技術同時采用上述三種抗原進行檢測，提高了檢測的陽性率。蛋白芯片的原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術將純化的結核分枝桿菌16KD蛋白和結核分枝桿菌38KD蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)三種抗原固定在同一膜片上，使抗原抗體反應在微孔濾膜上快速進行，以膠體金為標記物在膜上直接顯色，通過芯片閱讀儀和特定的軟件進行結果分析和判定，從而實現快速、靈敏、多通量的檢測。

早期快速診斷對結核病鑒定是一個重要環節，本研究對蛋白芯片檢測血清結核抗體與痰涂片鏡檢結核菌結果對比，由表1可以看出，臨床實驗及方法學比較顯示，對結核病人的診斷中，蛋白芯片法檢測血清結核抗體與痰涂片鏡檢陽性率具有顯著性差異。χ2=39.56 P＜0.05，蛋白芯片法的敏感度為83.0%，特異性為96.5%，結核抗體三個指標聯合檢測可提高痰涂片陰性者的檢出率，同時具有簡便、快捷和受主觀因素影響較低的優點。但該方法的局限性在于使用血清樣本的測定和對免疫力極度低下者可能無法檢出及其它分枝桿菌的交叉反應等。在痰液檢查中，痰涂片、抗酸桿菌鏡檢是我國目前應用最為廣泛的方法，它具有設備要求低，操作簡便等優點，適合各級醫療單位應用，但其敏感性低及操作者的個體差異對結果影響較大也是其比較大的缺點。故血清結核抗體蛋白芯片檢測是結核病輔助診斷的好方法，值得推廣。

[1]汪謀岳.中華醫學會結核病分學會2002年學術會議簡介[J].中華結核和呼吸雜志,2003,26(2):115-116.

[2]吳玉平,趙月娟,王永明,等.血清抗脂阿拉伯甘露聚糖抗體對活動性肺結核的診斷價值[J].中國微生態學雜志,2000,12(6):344-345.

[3]張小剛,莊玉輝,何秀云,等.重組結核分枝桿菌38KD和16KD蛋白用于結核病血清學診斷的價值[J].中國防癆雜志,2001,23(5):281-283.

[4]中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):18-31.