Sysmex XE-2100血液分析儀定量檢測成人網織血小板的方法學評價及參考區間建立

任春云，金明超，包丹妮，郭希超

(浙江大學醫學院附屬第一醫院檢驗科，浙江 杭州 310003)

網織血小板(reticulated platelet,RP)或未成熟血小板于1969年由Ingram和Coopersmith首次發現，其胞質中含有殘留核糖核酸(RNA)成分，被認為是一種新生的血小板,能較敏感地反映巨核細胞的血小板生成能力[1]，與成熟血小板相比，具有平均體積大和質量重的特點，應用于血小板減少、血小板增多癥的診斷和骨髓造血功能恢復的預測[2]。九十年代開始使用流式細胞儀檢測網織血小板，但因其操作復雜，缺乏質控，重復性差，價格貴等原因未能廣泛采用。目前Sysmex XE-2100血細胞分析儀通過軟件升級即可檢測網織血小板參數—未成熟血小板比率(IPF immature platelet fraction)，根據美國病理家協會(CAP)對實驗室質量管理和認可的要求[3]，實驗室必須對新檢測系統進行方法學評價并按就診人群建立各自的本實驗室參考區間，因此我們對Sysmex XE-2100檢測網織血小板參數IPF檢測系統進行性能評價試驗并建立了本實驗室的參考區間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選取患者IPF高、中、低值做相關性能評價，批間精密度采用同一批次質控；選取248例來自我院2009年11月～12月的健康體檢者，排除其他內外科疾病，血液生化及影像資料無明顯異常者，用于確定參考區間，其中男性122例，女性126例，年齡17～81歲，平均37歲。

1.1.2 標本采集 采用EDTA-K2抗凝管空腹采靜脈血2ml，混勻后于2h內檢測。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器及試劑 Sysmex XE-2100血細胞分析儀并且系統軟件升級版，聚次甲基染料、氨丁三醇緩沖液、鞘液試劑、質控等,均為該公司原裝配套試劑。

1.2.2 校準及質控 對Sysmex XE-2100血液分析儀用其配套校準品按校準程序校準，校準測定結果和靶值比較，根據需要對儀器參數進行修正，使結果和靶值偏差在可允許范圍內，表明校準合格。儀器每日測試前均做本底檢測和室內質控，檢測指標在質控通過后進行。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本檢測 采用CBC+RET通道自動計數,經稀釋并染色后檢測分析IPF。

1.3.2 精密度試驗 選取IPF中值 (10.2±0.5×109/L)、低值(3.1±0.3×109/L)兩種不同 IPF 水平的標本各10份,每份連續檢測11次，去掉第一次結果，取后10次結果評價中、低組標本批內CV；取三種水平的質控，連續檢測20天，評價批間CV。

1.3.3 攜帶污染率 取IPF絕對值高值 (21.2×109/L)標本、低值(4.0×109/L)標本各一份，連續檢測 3次高值標本 (H1、H2、H3)，再連續檢測3次低值標本(L1、L2、L3)，其攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.3.4 穩定性試驗 選取10名健康志愿者，同時采集2份標本，室溫保存(22℃左右)，分別用于：①短期穩定性：在 0、1、2 、4、8和 12 h后上機檢測。 ②長期穩定性：在 0、12、24、36h 后檢測。

1.3.5 分析測量范圍(AMR)評價 取IPF絕對值高值 (IPF%=14.0%、IPF#=50.4×109/L)和低值 (IPF%=7.1%、IPF#=0.4×109/L)，分別以 4:1、3:2、1:1、1:2、1:3、1:10比例混合，共8個水平標本，標本中IPF絕對值按照比例計算，每一水平檢測2次，計算，以期望值和測定值作回歸分析。

1.4 建立參考區間

1.4.1 取上述248例標本上述方法檢測分析結果。

1.4.2 統計學處理 采用SPSS 13.0分析軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，男女分組采用Z檢驗，正常參考區間采用95%可信區間表示，數據以x±s表示。

2 結果

2.1 精密度試驗(見表1、表2)。

表1 批內精密度

表2 批間精密度

2.2 攜帶污染率 IPF絕對值為：0.98%；IPF%為：0.36%。

2.3 穩定性試驗 標本在8h內檢測較穩定(CV均<6%),超過12h穩定性的變異系數CV偏高，提示檢測網織血小板應在8h內完成結果穩定 (：P[IPF%]=0.12，P[IPF#]=0.25)。 (見圖 1、表 3)。

2.4 分析測量范圍 利用SPSS相關和回歸分析，其相關系數γ=0.9975(P<0.01)，回歸方程y=0.9998x+1.3028(圖 2)。 按 α=1.00±0.05，γ≥0.97 為標準，AMR評價符合要求，本檢測系統IPF的AMR為：50.4～0.4×109/L。

圖1 均值隨時間變化圖

表3 IPF的穩定性

圖2 IPF AMR

2.5 參考區間建立 248例健康體檢者的血液標本IPF數據呈偏態分布，采用第2.5～97.5百分位數作為參考區間。男女分組采用Z檢驗[4]，IPF%:Z=4.16>Z*=3.05；IPF 絕對值：Z=3.95>Z*=3.05 男女組間存在差異，參考區間需要男女分組(見表4)。

表4 IPF的參考區間

3 討論

根據美國病理學家協會(CAP)對實驗室質量的管理要求，對新檢測系統必須驗證其相關分析性能。本實驗結果顯示，IPF%批內CV分別為4.9%、6.2%，批間CV分別為3.3%、3.9%、3.6%，IPF絕對值批內CV分別為 5.3%、8.0%，批間 CV分別為 3.4%、4.3%、4.8%，攜帶污染率分別為0.36%、0.98%，穩定性試驗中8h內變異系數CV分別為5.4%、5.6%，36h CV分別為16.2%、20.4%，表明檢(下轉第462頁)Dsg3抗體在天皰瘡患者和類天皰瘡患者中的陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

天皰瘡是自身免疫性疾病，其病理基礎是抗體沉積在表皮內棘層細胞間，從而引起棘層細胞松解，形成表皮內水皰，在臨床表現上與類天皰瘡不易區分。實驗室診斷方法有組織病理、直接免疫熒光、間接免疫熒光檢測自身抗體。在病損部位取活體組織用直接免疫熒光法檢測抗體，能看見IgG和C3沉積在棘層細胞間，而類天皰瘡病人抗體沉積在表皮基底膜處，可資鑒別，該法診斷清楚，結果可靠，且陽性率高[1]。天皰瘡患者的血清中有抗表皮物質間的抗體，一般使用猴食道或包皮為底物，用間接免疫熒光法可以檢出，但其陽性率在兩種底物上會有所不同。現代分子學已知尋常型天皰瘡(PV)和落葉型天皰瘡(PF)的抗原為來自表皮的鈣黏素超家族的糖蛋白，分別是橋粒芯糖蛋白3(Dsg3)、橋粒芯糖蛋白1(Dsg1)。我們用ELISA法檢測抗Dsg1抗體和抗Dsg3抗體，結果顯示，在天皰瘡病人血清中有較高的陽性率，而在類天皰瘡病人的血清中未發現陽性，兩者差異有統計學意義。

本研究中抗橋粒芯蛋白抗體的總陽性率高于文獻報道[2]，這可能與我們所選病人多數為活動期有關，因為據文獻報道天皰瘡患者病情與抗橋粒芯糖蛋白抗體水平有相關性[3]。綜上所述，直接免疫熒光法是一種十分可靠的診斷方法，但該法操作較復雜，結果判斷要求有一定的病理學基礎，而且取材不便，對于患者會造成損傷。間接免疫熒光檢測自身抗體受底物影響。ELISA法操作簡便，重復性好，待檢標本只需10μl血清，陽性率較高。因此，ELISA法檢測抗Dsg1抗體和抗Dsg3抗體在天皰瘡的診斷和病情監測中有重要價值。

致謝：南昌大學第二附屬醫院 王小中 博士 審閱。

[1]趙永鏗,羅瑞固,林頁新,等.天皰瘡患者不同部位皮膚及不同稀釋度熒光抗體直接免疫熒光檢查的對照研究 [J].中華皮膚科雜志,1989,23(4):228-229.

[2]張蜀瀾,佟大偉,李永哲,等.天皰瘡相關自身抗體的檢測及其臨床意義[J].檢驗醫學,2007,22(5):551-553.

[3]閆 言,王寶璽,渠 濤,等.天皰瘡患者病情與抗橋粒芯糖蛋白抗體水平的相關性研究[J].臨床皮膚科雜志,2003,32(9):512-514.