乙肝病毒攜帶產婦乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞 ，張 華 ，鄒懷賓 ，柳 鑫 ，李 卓 ，陳 煜 ，段鐘平

（1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院婦產科，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院人工肝中心，北京 100069）

乙肝病毒攜帶產婦乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞1，張 華1，鄒懷賓2，柳 鑫1，李 卓1，陳 煜2，段鐘平2

（1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院婦產科，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院人工肝中心，北京 100069）

目的：研究HBV攜帶產婦血清、乳汁及臍血中的HBV-DNA含量與其血清HBV標志物之間的關系，探討HBV攜帶產婦乳汁的傳染性。方法：對207例HBV攜帶產婦，采用電化學發光方法檢測產婦的乙肝五項及采用熒光定量PCR技術檢測HBV攜帶產婦血清、乳汁及臍血中的HBV-DNA含量。結果：125例HBsAg和HBeAg雙陽性的產婦，其乳汁HBV-DNA陽性率為9.6%，82例HBsAg陽性但HBeAg陰性的產婦，其乳汁HBV-DNA陽性率為2.4%。兩組乳汁HBV-DNA陽性率差異有統計學意義（χ2=4.027，P=0.045)；血清HBV-DNA<106copies/ml的產婦其產婦乳汁及臍血中HBV-DNA均為陰性。血清HBV-DNA≥106copies/ml的產婦其乳汁HBV-DNA陽性率為12.5%、其新生兒臍血陽性率為15.17%，與血清HBV-DNA<106copies/ml的產婦相比較差異均有統計學意義（P均<0.001）。結論：對于HBsAg陽性的產婦，HBsAg和HBeAg雙陽性的產婦乳汁傳染性高于HBsAg單陽性的產婦，血清HBVDNA≥106copies/ml的產婦乳汁傳染性高于血清HBV-DNA<106copies/ml的產婦。

肝炎病毒；乙型；臍血；母嬰傳播；乳汁

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染目前仍是一個全球性的公共衛生問題[1]，乙型肝炎病毒核酸基因（HBVDNA）是反映HBV復制及傳染性的直接指標，母嬰傳播是乙肝病毒的主要傳播途徑之一，關于產后母乳喂養是否引起HBV感染的重要因素的研究已受到醫學界的關注[2-4]。本文對207例（2007年6月～2008年1月）在本院分娩并自愿參加此次臨床研究的的HBV攜帶產婦的血清、乳汁及新生兒臍血血清進行HBV-DNA定量檢測，對HBV攜帶產婦乳汁的傳染性進行了探討，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

207例HBV攜帶產婦為2007年6月～2008年1月在本院分娩并自愿參加此次臨床研究的產婦,年齡19～39歲,平均28.6歲，肝功能丙氨酸氨基轉移酶（ALT）均正常，無其他并發癥。

1.2 標本采集及處理

1.2.1 孕婦外周血收集 所有檢測對象均抽取靜脈血3 ml注入試管，靜置60 min，以3 000 r/min，離心20 min，分離血清，-80℃保存待檢測HBV-M和HBV-DNA。

1.2.2 新生兒臍帶血標本收集 陰道分娩或剖宮產術中，胎兒娩出斷臍后，用2%碘酒消毒臍帶，5 ml無菌注射器抽取3 ml臍動脈血，注入試管后送檢。靜置60 min，以3 000 r/min，離心20 min，分離血清，-80℃保存待檢HBV-DNA。

1.2.3 乳汁標本收集 乳汁采集于產婦分娩后3～5 d，乳房局部清洗消毒，用一次性無菌容器采取乳汁2 ml，10 000 r/min，離心5 min，留取沉淀物加入無菌0.9%氯化鈉溶液1 ml混勻，10 000 r/min，離心5 min，吸干上清液（用無菌0.9%氯化鈉溶液洗滌沉淀物約3次），加入40 μl DNA提取液充分混勻100℃，10 min 10 000 r/min 離心 5 min， 吸取上清液 2 μl用于PCR反應，待檢HBV-DNA。

1.3 檢測方法、試劑和主要儀器

母親乙肝五項均采用電化學發光方法，試劑購自美國Abbott公司，儀器使用美國Abbott公司i2000全自動化學發光免疫分析儀。

母親血清、乳汁及臍血的HBV-DNA定量采用熒光定量PCR檢測技術，試劑購自上?？迫A生物公司，儀器采用Fluo-Cycle實時熒光定量PCR儀。

1.4 統計學分析

采用SPSS 15.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕婦血清免疫學指標與乳汁HBV-DNA陽性的關系

HBsAg和HBeAg雙陽性組產婦與HBsAg陽性但HBeAg陰性組產婦乳汁HBV-DNA陽性率差異有統計學意義（P=0.045），見表 1。

表2 孕婦血清HBV-DNA病毒載量與乳汁及新生兒臍血HBV-DNA陽性的關系

表1 產婦血清免疫學指標與乳汁HBV-DNA陽性的關系

2.2 產婦血清HBV-DNA病毒載量與乳汁及新生兒臍血HBV-DNA陽性的關系

207例產婦血清HBV-DNA<106copies/ml 95例，其產婦乳汁及新生兒臍血中檢出HBV-DNA均為陰性。產婦血清HBV-DNA≥106copies/ml為112例，其產婦乳汁HBV-DNA陽性14例，乳汁HBV-DNA陽性率為12.5%，其中106水平有2例，107水平有2例，108水平有9例，109水平有1例。血清HBV-DNA≥106copies/ml組產婦與HBV-DNA<106copies/ml組產婦乳汁HBV-DNA陽性率差異有統計學意義（P=0.000）。產婦血清HBV-DNA≥106copies/ml其新生兒臍血中檢出HBV-DNA陽性17例，HBV-DNA陽性率為15.17%。血清HBV-DNA≥106copies/ml組產婦與HBV-DNA<106copies/ml組產婦所分泌嬰兒的臍血HBV-DNA陽性率差異有統計學意義（P=0.000），見表 2。

3 討論

當今學術界認為HBV母嬰傳播主要的途徑有3個，①宮內感染：HBV在胎盤內復制經血和（或）細胞傳遞是HBV宮內傳播的主要途徑。其傳播的機制可能為，當HBV感染胎盤后，由HBsAg介導的免疫復合物反應使部分絨毛纖維素樣壞死，通透性增加，導致病毒穿透胎盤屏障感染胎兒。②產道感染：當母體帶有大量乙肝病毒時，乙肝病毒可通過宮內傳播或分娩時胎兒吸入受污染的羊水、血及陰道分泌物或因微小的皮膚黏膜損傷致使含有HBV的母血進入胎兒循環導致感染（產道感染），所以要重視產時傳播。③產后感染：眾所周知，母乳是嬰兒最理想的天然食品，但也可能是引起產后感染的重要因素。

金春子等[4]、羅世香等[5]報道，HBV攜帶者乳汁中檢出HBV-DNA，母乳喂養可能是傳播HBV的途徑之一。因為HBV雖為嗜肝性病毒，但也侵犯其他細胞，淋巴細胞、精細胞中也發現有HBV-DNA的整合[6]。由于早期的母乳中存有大量淋巴細胞，故不能排除HBV-DNA在母乳中整合和復制成HBV的可能性。當新生兒或嬰兒消化道任何一處（口腔、咽、食道、胃、腸道）黏膜因炎癥發生水腫、滲出，導致通透性增加或黏膜直接破損時，母乳中的有害物質就可能通過毛細血管網進入血循環而引起乙肝感染。這種危險性也存在于耳、鼻、面部有破損的溢奶嬰兒。

HBV-DNA是HBV的基因組成與復制模板，它的檢出是HBV感染的直接依據，也是衡量傳染性強弱的重要指標之一。因此，乳汁中HBV-DNA的濃度的高低與傳染風險呈正相關。本研究結果顯示：產婦血清HBV-DNA<106copies/ml時，其乳汁HBV-DNA為陰性，但當產婦血清HBV-DNA≥106copies/ml時，其乳汁HBV-DNA陽性率為12.5%。這一結果表明產婦血清HBV-DNA濃度≥106copies/ml時，乳汁具有傳染性的可能性較大，其分娩的嬰兒感染HBV的概率會增加，應同時檢測乳汁HBV-DNA的結果，盡量避免哺乳。尤其是產婦血清和乳汁中HBV-DNA同時為陽性，新生兒血清HBV-DNA陰性，而幸免宮內感染，更應避免哺乳，以便預防產后的母嬰傳播。對于HBeAg陰性而血液和乳汁HBV-DNA陰性的產婦，在其嬰兒接受主被動聯合免疫后，乳汁具有傳染性的可能性較小，可在醫生的指導下考慮母乳喂養。高病毒載量的孕婦，新生兒臍血的病毒載量高。如果新生兒血清HBV-DNA陽性，證明新生兒已被感染，則母乳喂養利大于弊。游泳等[7]研究證明，臍血HBV-M及HBV-DNA檢測結果與新生兒靜脈血HBV-M及HBV-DNA檢測結果相比較，差異無統計學意義，提示采用臍血檢測了解胎兒宮內是否受乙肝病毒感染是可行的。

本實驗中，新生兒臍血中HBV-DNA總陽性率為8.21%，產婦血清HBV-DNA濃度高者，其乳汁及臍血的陽性率也明顯升高。所以，應注意HBsAg陽性婦女母乳喂養前應檢測血HBV-DNA，復制活躍者應考慮采取人工喂養措施，以盡量減少母嬰傳播的危險。由于HBV在產婦的初乳中即可能排出，這對從新生兒起預防HBV感染提出了新要求。HBV攜帶產婦準備母乳喂養者，在進行母乳喂養前需檢測乳汁中的HBV-DNA定量，這可能是預防和阻斷產后HBV母嬰傳播的有效措施之一。

[1]World Health Organization.Hepatitis B.World Health Organization Fact Sheet 204 dex.(Revised October 2000).WHO Web site[OL].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/in html.

[2]Yao JL.Perinatal transmission of hepatitis B virus infection and vaccination in China[J].Gut,1996,38(1):S37-38.

[3]林堅,廖蒔,王春平.乙型肝炎病毒DNA定量檢測與母嬰傳播的研究[J].中華圍產醫雜志,2000,3(4):211-213.

[4]金春子,賈卉.132例乳汁中HBV-DNA PCR檢測結果分析[J].中國優生與遺傳雜志,1997,5(5):20-22,26.

[5]羅世香,焦存仙.檢測孕婦血清、乳汁及新生兒血清乙肝標志物的優生學意義[J].中國優生與遺傳雜志,2000,8(2):74,115.

[6]Feinman SV,Berris B,Guha A,et al.DNA:DNA hybrization method for the diagnosis of HBV[J].J Viral Meth,1984,8(3):199-206.

[7]游泳,邢愛耘,鄭瑩,等.臍血與新生兒靜脈血檢測乙型肝炎病毒標志物及 DNA的對比研究[J].四川大學學報(醫學版),2005,36(2):290-291.

Study on HBV DNA in breast milk in pregnant women with HBV carrier

ZHU Yunxia1,ZHANG Hua1,ZOU Huaibin2,Liu Xin1,Li Zhuo1,CHEN Yu2,DUAN Zhongping2
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Artificial Liver Center,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

Objective:To study the relationship between the load of HBV-DNA in serum and breast milk and the serum HBV makers of pregnant women with HBV carrier,to explore the infectivity of breast milk in pregnant women with HBV carrier.Methods:A total of 207 pregnant women with HBV carrier and their neonates entered the study.Serum HBV-markers of the women were detected using electrical chemiluminescence immunoassay,the load of HBV-DNA in serum and breast milk of the women and in umbilical cord blood of the neonates were tested by real-time quantitative polymerase chain reaction.Results:The positive rate of HBV-DNA in breast milk was 9.6%and 2.4%in HBeAg-positive mothers group and HBeAg-negative mothers group,respectively(χ2=4.027，P=0.045),the positive rate of HBV-DNA in breast milk was 12.5%and in mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively,the positive rate of HBV-DNA in umbilical cord blood was 15.17%and in neonates born to mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively(P all<0.001).Conclusion:For the pregnant women with HBV carrier,mothers with HBeAg positive or HBV-DNA≥106copies/ml can increase the infectivity of breast milk.

Hepatitis B virus;Umbilical cord blood;Mother-to infant transmission;Breast milk

R512.6+1

A

1674-4721（2010）09（a）-007-03

張華（1955-），女，主任醫師；研究方向：乙型肝炎的母嬰阻斷。段鐘平，男，主任醫師；首都醫科大學附屬北京佑安醫院副院長，北京市人工肝治療培訓中心主任，衛生部中國肝炎防治基金會治療及預防技術咨詢中心副主任；擔任中華肝病學會常委，中華肝病學會重肝與人工肝學組組長，中華醫院管理學會血液凈化分會常委，擔任多家學術專業雜志的編委或常務編委，北京市和科技部肝病重大科技攻關項目首席專家，全國人工肝及血液凈化攻關協作組組長；曾到多個國家進行訪問交流，發表學術論文40多篇，出版著作5本，獲得衛生部等成果9項。

2010-07-20）