復(fù)方維生素注射液（4）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

胡守蓮，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南信陽 464000）

復(fù)方維生素注射液（4）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

胡守蓮，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南信陽 464000）

目的：建立復(fù)方維生素注射液（4）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法。方法：用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑對(duì)兩個(gè)廠家6個(gè)批號(hào)的復(fù)方維生素注射液（4）分別進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察確立該品種細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法。結(jié)果：復(fù)方維生素注射液（4）對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾作用，但稀釋100倍以上可消除。結(jié)論：可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）代替家兔熱原檢查法控制其熱原。其細(xì)菌內(nèi)毒素限值為50 EU/ml。

復(fù)方維生素注射液（4）；鱟試劑；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾試驗(yàn)

復(fù)方維生素注射液（4）為維生素類藥物，是機(jī)體維持正常代謝和功能所必需的一類低分子化合物。其多數(shù)由食物提供，少數(shù)可在體內(nèi)合成或由腸道細(xì)菌產(chǎn)生[1]，主要用于大面積及嚴(yán)重創(chuàng)傷者、外科疾病伴有腸功能障礙者(如腸瘺、短腸綜合征)、危重患者中較長時(shí)間不能進(jìn)食者。靜脈滴注給予維生素能對(duì)危重患者起到維持、延長和挽救生命的作用，對(duì)正常進(jìn)食或超高代謝的患者起到糾正負(fù)氮平衡，促進(jìn)傷口愈合，增加體重以及提高存活率的作用[2]。本品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH19942005[S]，該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下以熱原（家兔法）檢查來控制熱原質(zhì)。由于家兔法操作比較繁瑣，環(huán)境要求高，成本比較大，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏快速、簡便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，故筆者參照《中國藥典》2005年版二部附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 （BET）[2-4]的要求，對(duì)采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）對(duì)復(fù)方維生素注射液（4）進(jìn)行檢測的可行性進(jìn)行探討。

1 材料與儀器

復(fù)方維生素注射液（4）[規(guī)格 2 ml，批號(hào)：080926、090320、080926，陜西秦光制藥廠；規(guī)格 2 ml，批號(hào)：0905301、0804181、0804171，四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)前熱原檢查均符合規(guī)定）。內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE）（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：2009-10，每支 100 EU）。 鱟試劑（TAL）（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：0911220，規(guī)格 0.1 ml，靈敏度0.25 EU/ml；湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：0906020，規(guī)格0.1 ml，靈敏度0.25 EU/ml）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào) W2009－3，每支 10 ml）；電熱恒溫水浴箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）。2H-2自動(dòng)旋渦混合儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

按照《中國藥典》2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行[4]，結(jié)果（見表 1）：鱟試劑靈敏度在 0.5～2.0 λ 之間，結(jié)果符合規(guī)定。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.2 內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)公式L=K/M，L為樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；K為按規(guī)定的給藥途徑，人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人每千克體重每小時(shí)用藥最大劑量；本品人用每次最大劑量為2 ml（加入500 ml葡萄糖、氯化鈉、氨基酸等輸液中靜脈滴注），即M＝2/60＝1/30 ml/(kg·h)（人均體重按 60 kg 計(jì)），則 L＝K/M=5/（1/30）=150 EU/ml。 為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證人體用藥安全，把L值定為50 EU/ml.

2.3 干擾試驗(yàn)

2.3.1 干擾預(yù)試驗(yàn) 由于本品的L值定為50 EU/ml,所以對(duì)應(yīng)于市場常見的鱟試劑（靈敏度為0.50～0.03 EU/ml），按照公式MVD＝CL/λ 計(jì)算，得到系列有效稀釋度的樣品液，即 1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600。采用靈敏度 λ＝0.25 EU/ml的鱟試劑，將樣品用 BET 水配制成 1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 的5個(gè)系列濃度，作為供試品液（NPC），并配制此系列稀釋液分別含2 λ的供試品陽性液（PPC），分別將NPC和PPC兩個(gè)系列的樣品液與鱟試劑反應(yīng)（37℃，60 min）[5]，結(jié)果見表2。

表4 復(fù)方維生素注射液（4）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

表2 預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

2.3.2 干擾實(shí)驗(yàn) 用BET水和1∶200的樣品稀釋液將WSE稀釋成 0.500、0.250、0.125、0.062 EU/ml的 2 個(gè)系列濃度，并與兩個(gè)廠家的TAL反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4管，結(jié)果顯示兩個(gè)系列的內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度均在0.5～2.0 λ之間[6]。見表3。

表3 復(fù)方維生素注射液（4）干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 復(fù)方維生素注射液（4）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取兩個(gè)廠家生產(chǎn)的復(fù)方維生素注射液（4）各3批（陜西秦光制藥廠，規(guī)格：2 ml，批號(hào)：080926、090320、080926；四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 ml，批號(hào)：0905301、0804181、0804171），分別用 BET 水配制成 1∶200 的稀釋液，用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑，按照《中華人民共和國藥典》2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[4]依法檢查。結(jié)果見表4。

3 討論

為初步確定復(fù)方維生素注射液（4）對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)的影響，確定最大不干擾濃度，正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)[7-9]，試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方維生素注射液（4）對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾作用，但稀釋100倍以上可消除。

為進(jìn)一步考察供試品對(duì)鱟試劑是否存在干擾作用，筆者采用兩個(gè)廠家的鱟試劑（靈敏度均為0.25 EU/ml），兩個(gè)廠家的6批樣品進(jìn)行了正式干擾試驗(yàn)，結(jié)果表明樣品在最大稀釋濃度（200倍）不干擾實(shí)驗(yàn)，可依該方法進(jìn)行檢測。

用兩個(gè)廠家鱟試劑分別與兩個(gè)廠家的6批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，其結(jié)果均符合規(guī)定，這與熱原檢查的結(jié)果一致。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明采用鱟試劑法（凝膠法）代替?zhèn)鹘y(tǒng)的家兔法對(duì)復(fù)方維生素注射液（4）的熱原質(zhì)進(jìn)行控制是完全可行的，其內(nèi)毒素限值為50 EU/ml。

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Establish of the Bacterial Endotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection

Objective:To establish the BacterialEndotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection.Methods:The interference test of 6 batches of samples with 2 limulus test agents was carried out.Results:There was interference effect of Compound Vitamin(4)Injection on the reaction of bacterial endotoxin and tachypleus amebocyte lysate.But the interference can be neutralized by diluting the solution concentration to 1∶100.Conclusion:These results suggest that the Bacterial Endotoxins Test can be used for the detection of endotoxin in Compound Vitamin(4)Injection instead of pyrogen test,and its endotoxin limit concentration can be established as less than 50 EU/ml.

Compoundvitamin(4)injection;Limulus test agent;Bacterial endotoxins test;Interference test

R977.2

B

1674-4721（2010）09（b）-044-02

胡守蓮，女，主管藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)。

HU Shoulian,LI Daoming

(Institute for Food and Drug control of Henan Xinyang,Xinyang 464000,China)

2010-07-07）