HPLC測定歸脾丸(濃縮丸)中黃芪甲苷的含量

王 景

（解放軍第153醫院，河南鄭州 450007）

HPLC測定歸脾丸(濃縮丸)中黃芪甲苷的含量

王 景

（解放軍第153醫院，河南鄭州 450007）

目的：建立歸脾丸(濃縮丸)中黃芪甲苷含量的HPLC測定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，使用Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（34∶66）作為流動相。流速 1.0 ml/min，檢測波長 205 nm。結果：黃芪甲苷在12.5～100.0 μg/ml范圍內線性較好（r=0.999 7），平均回收率為98.34%（RSD為0.41%）。結論：該方法快速、簡便、可靠、準確度高、重復性好，處方中其他成分對測定亦無干擾，分離效果好，可用于歸脾丸中黃芪甲苷含量測定。

歸脾丸；黃芪甲苷；高效液相色譜法；含量測定

歸脾丸(濃縮丸)收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑(第七冊)》，標準編號：WS3-B-1303-93，由黨參、黃芪(蜜炙)、白術（炒）、甘草(蜜炙)、遠志(制)、酸棗仁、當歸、木香等 11 味藥組成，具有益氣健脾、養血安神之功效。用于心脾兩虛、氣短心悸、失眠多夢、頭昏頭暈、肢倦乏力、食欲不振、崩漏便血。歸脾丸中黃芪來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性溫、味甘，為常用中藥，具有補氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效[1]。黃芪總皂苷是黃芪的主要有效部位，黃芪甲苷作為總皂苷的主要活性指標成分之一，常用作黃芪藥材及含黃芪復方制劑的質量評價指標[2]。歸脾丸制劑標準尚無含量測定項，為了提高藥品質量，本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測定歸脾丸中黃芪甲苷含量的方法，現報道如下：

1 儀器與試劑

1.1 儀器

日本島津LC-2010C高效液相色譜儀。

1.2 試劑

黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200613），歸脾丸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號：090105，090405，090707）。乙腈為色譜醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20080102），水為純化水，其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（34∶66），流速為 1.0 ml/min，檢測波長為 205 nm，進樣體積為20 μl，柱溫為室溫，理論板數不低于4000。

2.2 實驗溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50 μg/ml的黃芪甲苷。其作為對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細粉約5 g，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內經為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 ml洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，備用[3]。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 取不含黃芪的空白制劑樣品，照2.2.2項下供試品溶液制備方法制備，備用。

2.3 系統適用性實驗

分別吸取2.2項下對照品溶液，供試品溶液，陰性供試品溶液各20 μl注入色譜儀記錄色譜圖，黃芪甲苷對照品峰位置無假陽性峰干擾，黃芪甲苷峰與其他峰分離完全，陰性供試品溶液在黃芪甲苷出峰位置無干擾。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 取上述對照品溶液分別進樣5、10、20、15、40 μl，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為橫坐標，進樣濃度（μg/ml）為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為：Y＝15903X+4660.7（r=0.9997）。 這表明黃芪甲苷在 12.5～100.0μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取2.2.1項下對照品溶液20 μl，分別重復進樣5次，結果黃芪甲苷峰面積的平均值為316840，其RSD為0.78%。結果表明，儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取樣品（批號：090105），按供試品制備方法制備。于 0、4、8、12、16 h 進樣分析，記錄峰面積，其 RSD 為0.81%，其結果表明供試品溶液在16 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批號(090105)的樣品5份，按供試品制備方法制備，測定含量，結果表明方法重復性較好。具體見表1。

表1 重復性實驗

2.4.5 回收率試驗 取本品（批號：090105）適量，共9份，約為2.5 g的80%、100%、120%，精密稱定，加入一定量的黃芪甲苷對照品，按2.2.2項下方法制備，注入高效液相色譜儀，測定，計算回收率。測得黃芪甲苷平均加樣回收率(n=9)為99.71%，RSD=0.35%。結果表明，用高效液相法測定黃芪甲苷含量準確度高。具體測定結果見表2。

表2 回收率實驗（n=9）

2.4.6 含量測定 供試品溶液以2.2.2項下方法制備，用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，在2.1項下色譜條件下進樣，由峰面積值根據線性回歸方程計算含量(表3)。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 樣品提純方法的考察

本實驗參考《中國藥典》2010版一部和有關文獻，確定以正丁醇萃取。氨試液洗滌正丁醇萃取液以除去提取液中色素、酸性成分的干擾，然后經D101型大孔吸附樹脂柱，用70%乙醇洗脫，洗脫液蒸干，再用甲醇溶解。實驗結果顯示方法學考察均符合要求。

3.2 檢測波長的確定

取2.2.1項下的溶液，在200～400 nm波長范圍掃描，結果在205 nm處有較大吸收，故選用205 nm波長處作為檢測波長。

3.3 檢測方法的選擇

已報道的黃芪甲苷的含量測定方法有：紫外分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法和熒光法[4]采用薄層掃描法、比色法檢測周期長，重現性差。近年來，文獻報道黃芪中黃芪甲苷含量采用HPLC-ELSD法測定，該法具有高效、靈敏、快速等優點，但該法計算繁瑣，影響因素多。本文采用HPLC法測定歸脾丸中黃芪甲苷的含量，操作簡便、準確、靈敏度高，陰性無干擾，可作為該制劑的質量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學工業出版社,2005:212-213.

[2]張金紅,周晶,吳志麗,等.HPLC-ELSD法測定黃芪及金芪降糖片中黃芪甲苷的含量[J].天津醫科大學學報,2010,16(1):26-29.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[M].一部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:284.

[4]蔣紅艷,楊元娟,何靜,等.黃芪及其制劑中黃芪甲苷定量分析方法研究進展[J].中國醫藥指南,2009,7(10）:209-211.

Determination of Astragaloside IV in Guipi pill(Concentrated Pills)by HPLC

WANG Jing
(153 Hospital of PLA,Henan Province,Zhengzhou 450007,China)

Objective:To establish a method for content determination of Astragaloside IV in Guipi pill(concentrated Pills)by HPLC.Methods:The experimental condition of the RP-HPLC method was as follows:Agilent HC-C18column(5μm，250×4.6mm)，with linear gradient elution using methanol and water （34∶66）;The flow rate was 1.0 ml/min;Detected wave length was 205 nm.Results:Astragaloside IV demonstrated good linear relationship in the range of 12.5～100 μg/ml （r=0.999 7）.The average recovery rate was 98.34%withRSDof 0.41%.Conclusion:The method is simple,reliable,accurate and It could be used in the determination of Astragaloside IV in Guipi pill.

Guipi pill;Astragaloside IV;HPLC;Determination

R943.1

B

1674-4721（2010）09（b）-046-02

2010-07-16)