化瘀瀉濁方對(duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)*大鼠TGF-β1、p-Smad2/3的影響

潘利敏，王鳳麗，王彥凱，商亞茹，王月華△

(1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011;2.石家莊長城體檢中心，河北 石家莊 050017)

化瘀瀉濁方對(duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)*大鼠TGF-β1、p-Smad2/3的影響

潘利敏1，王鳳麗1，王彥凱2，商亞茹1，王月華1△

(1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011;2.石家莊長城體檢中心，河北 石家莊 050017)

目的:觀察化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠TGF-β1、p-Smad 2/3的影響。方法:選用健康、雌性 SD大鼠50只，用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法復(fù)制大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，將其隨機(jī)分為纈沙坦組［給予纈沙坦5.3mg/(kg·d)經(jīng)口灌服］、化瘀泄?jié)岱浇M［化瘀泄?jié)岱?.7g/(kg·d)經(jīng)口灌服］、阿魏酸哌嗪分散片組［給予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)］與模型組［給予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服］，并設(shè)假手術(shù)組，每組10只大鼠。行 HE、Masson染色觀察實(shí)驗(yàn)大鼠梗阻側(cè)腎臟組織形態(tài)學(xué)改變并用免疫組化方法檢測(cè)觀察實(shí)驗(yàn)大鼠梗阻側(cè)腎臟轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGFβ1)及p-Smad 2/3在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:模型組及各治療組與假手術(shù)組相比均呈現(xiàn)程度不同的病理損害，梗阻腎間質(zhì)TGFβ1、p-Smad 2/3蛋白的表達(dá)也增加(P<0.05)。各治療組與模型組比較，TGFβ1、p-Smad 2/3表達(dá)明顯減少(P<0.05)。治療各組間比較，化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論:輸尿管梗阻后腎組織呈現(xiàn)程度不同的病理損害，腎纖維化面積明顯增加，這可能與TGFβ1、p-Smad 2/3表達(dá)增加有關(guān)，化瘀泄?jié)岱綄?duì)其有一定的抑制作用。

化瘀泄?jié)岱?單側(cè)輸尿管結(jié)扎;腎間質(zhì)纖維化;轉(zhuǎn)化生長因子β1;p-Smad 2/3

腎間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis TIF)是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同病理特征，減輕腎間質(zhì)纖維化的程度能顯著延緩慢性腎臟病向終末期腎病的進(jìn)展速度。

化瘀泄?jié)岱绞俏覀冊(cè)谂R床上用治慢性腎衰的常用方，取得了較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用化瘀泄?jié)岱綄?duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateralureteral obstruction UUO)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，通過觀察化瘀泄?jié)岱綄?duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物梗阻側(cè)腎臟病理形態(tài)學(xué)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)及 p-Smad 2/3的影響，探討化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用及部分作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用健康、雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180g±10g，清潔級(jí)，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)冀醫(yī)動(dòng)管字第703058號(hào)。

1.1.2 主要試劑 TGF-β1、p-Smad 2/3抗體由Santa Curz公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 化瘀泄?jié)岱接缮S芪30g、生大黃 12g、地龍 12g、丹參 15g、蒲公英 15g、槐花15g、生牡蠣30g、赤芍15g等組成，由河北省中醫(yī)院藥房提供。上藥按比例稱取后，水煎、過濾、濃縮并裝入瓶中密封備用。纈沙坦由諾華公司提供(批號(hào)X0538)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型和分組 動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組，每組10只。纈沙坦組給予纈沙坦5.3mg/(kg·d)經(jīng)口灌服;化瘀泄?jié)岱浇M給予化瘀泄?jié)岱?.7g/(kg·d)經(jīng)口灌服;阿魏酸哌嗪分散片組給予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)經(jīng)口灌服;假手術(shù)組和模型組給予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服。手術(shù)前1d開始給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1d。左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。除假手術(shù)組外其余各組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。于實(shí)驗(yàn)第21天全部殺檢，取左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并采用免疫組化方法檢測(cè) TGF-β1、p-Smad 2/3 的表達(dá)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法(SABC法) 半定量分析:采用HPIAS-1000型全自動(dòng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個(gè)視野，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量，最后取平均值，TGF-β1的結(jié)果分析是相對(duì)陽性面積=陽性染色面積/視野大小×100%，p-Smad 2/3的結(jié)果分析是計(jì)算一個(gè)視野場(chǎng)中強(qiáng)陽性著色核占小管細(xì)胞核總數(shù)的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA，組間兩兩顯著性比較采用 LSD法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE及Masson染色結(jié)果

腎組織HE及Masson染色顯示，模型組腎間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤和纖維組織增生，腎小管部分萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張，腎小球數(shù)目明顯減少，面積縮小。腎小囊黏連或擴(kuò)張，小囊周圍大量纖維組織增生。其他各治療組間質(zhì)可見多少不等的炎細(xì)胞浸潤，少量纖維組織增生，腎小管輕度擴(kuò)張，部分腎小球輕度萎縮，小囊擴(kuò)張，腎小球數(shù)量無明顯改變。

2.2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積半定量分析結(jié)果

表1 各組大鼠纖維化面積及ck蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠纖維化面積及ck蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果比較(±s)

注:與正常組比較:△P<0.01;與模型組比較:□P<0.01;與阿魏酸組比較:○P<0.01

組別n(例數(shù)) 纖維化面積(μm2) TGFβ1(%) p-Smad 2/3(%)假 手 術(shù) 組872.41± 116.62 19.51±2.81 4.63±0.77模 型 組 8 7830.78±1250.80△ 70.25±2.49△ 32.10±1.73△纈 沙 坦 組 9 4532.72± 639.56△□○ 40.27±3.64△□○ 17.61±1.25△□○化 瘀 泄 濁 方 組 9 4660.27± 991.14△□○ 41.24±3.42△□○ 18.57±1.36△□○阿魏酸哌嗪分散片組 9 5852.09± 900.44△□ 54.93±2.83△□ 24.85±1.57△□F值82.476 338.080 516.131

表1顯示，模型組腎間質(zhì)纖維化程度較重;纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組比較，腎間質(zhì)纖維化面積明顯減少(P<0.05)，提示化瘀泄?jié)岱健⑽核徇哙悍稚⑵袄i沙坦均有拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用，其中化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

2.3 TGFβ1蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果

假手術(shù)組 TGFβ1蛋白呈弱陽性表達(dá)于腎小球內(nèi)。與假手術(shù)組比較，其余各組在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著增強(qiáng)，間質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)亦有強(qiáng)表達(dá)。半定量分析顯示，模型組及各治療組較假手術(shù)組TGF-β1的表達(dá)呈顯著性升高(P<0.01);纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組相比，TGFβ1的表達(dá)均呈顯著性下降(P<0.05)，其中化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

2.4 p-Smad 2/3蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果

主要表達(dá)于小管的上皮細(xì)胞核和間質(zhì)的浸潤單核細(xì)胞核中。半定量分析顯示，模型組及各治療組較假手術(shù)組p-Smad 2/3的表達(dá)呈顯著性升高(P<0.01);纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組相比，p-Smad 2/3的表達(dá)均呈顯著性下降(P<0.05)，其中化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

3討論

3.1 化瘀泄?jié)岱降挠盟幰罁?jù)

各種慢性腎臟疾病遷延不愈，最終均導(dǎo)致慢性腎衰竭，腎間質(zhì)纖維化是慢性腎衰竭的主要病理特征。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法為研究腎間質(zhì)纖維化的典型模型。本病屬于中醫(yī)“淋證”、“腰痛”、“癃閉”、“關(guān)格”等范疇，其病因病機(jī)有以下幾個(gè)方面。一是先天異常。腎為先天之本，稟賦于父母之精氣，若先天不足，腎精虧虛，則尿管及腎發(fā)育異常;二是濕熱蘊(yùn)結(jié)。外邪入侵，郁而化熱，蘊(yùn)結(jié)于腎與膀胱;或內(nèi)熱下移，濕熱互結(jié)，膀胱氣化不利，水液內(nèi)停;三是瘀血絡(luò)阻。久病多瘀，血不利則病水，瘀血阻滯，尿路不暢，水濕郁結(jié)于內(nèi);或瘀血內(nèi)阻，氣滯血瘀，阻塞尿路。總之，本病是以濕熱、瘀血、絡(luò)阻等為基本病機(jī)，且相互轉(zhuǎn)化，相互影響。本實(shí)驗(yàn)以化瘀泄?jié)嶂兴帉?duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，符合上述病機(jī)具有可行性。方中丹參、赤芍、大黃、地龍活血通絡(luò)，化瘀泄?jié)?蒲公英、槐花清熱利濕，解毒泄?jié)?加用生牡蠣軟堅(jiān)散結(jié);生黃芪益氣，且黃芪益氣有走而不守之性，所以本品益氣不僅可以扶正固本，又可以助丹參、地龍等行血消瘀通絡(luò)祛邪治標(biāo)。諸藥相伍通補(bǔ)并用、標(biāo)本兼顧，故成為我們臨床用于延緩腎臟病發(fā)展進(jìn)程的基礎(chǔ)方。

3.2 化瘀泄?jié)岱降淖饔脵C(jī)理探討

腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fiborsis)是多種慢性腎臟疾病如慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等發(fā)展到終末期腎衰的共同途徑，它以過量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征，眾多細(xì)胞因子參與該過程，如轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transform growth factorβ1，TGFβ1)。近年發(fā)現(xiàn)，Smads 蛋白是 TGFβ1家族信號(hào)從受體到核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，TGFβ1/Smad通路是公認(rèn)的纖維化過程中的重要通路，其下游分子Smad 2/3的磷酸化代表了該通路的激活。Smad2、3為受體激活型蛋白，與 TGF-β的 I型受體結(jié)合形成受體復(fù)合物，在磷酸化后從受體復(fù)合物上釋放出來，與胞漿內(nèi)的Smad4結(jié)合形成低聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)激活核內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分，如各型膠原等啟動(dòng)子的活性，從而細(xì)胞外基質(zhì)合成增加。因此，我們通過觀察 TGFβ1和磷酸化 Smad 2/3(p-Smad 2/3)的表達(dá)，探討化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化瘀泄?jié)岱侥軠p輕腎臟病理損害，減少纖維化面積，抑制腎組織 TGFβ1、p-Smad 2/3蛋白的表達(dá)，從而延緩病變腎組織纖維化進(jìn)程。

△通訊作者:王月華，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合腎病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0775-02

河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(2008022，2009028)

2010-02-17

潘利敏(1970-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合腎病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。