高效液相色譜法檢測兔血漿中甲氧滴滴涕的濃度

周紅宇，肖仲祥，張馨，王萍，胡國新

（溫州醫學院 藥學院，浙江 溫州 325035）

甲氧滴滴涕（methoxychlor，MXC），又稱甲氧氯，化學名為1，1-三氯-2，2-雙（4-甲氧基苯基）乙烷，屬有機氯殺蟲劑，因具有高效和低殘留的特點而取代滴滴涕（DDT）廣泛應用，在土壤、工業廢水及城市污水中均有檢出[1-2]。近年來的研究表明MXC能干擾生殖內分泌系統，降低生育能力，并且具有遺傳毒性，是重要的農藥類內環境干擾物[3-6]。MXC為脂溶性物質，在受污染的環境中的可通過胃腸道、皮膚及呼吸道進入機體，但其在體內的毒動學過程尚缺乏研究。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法檢測血漿樣品中的MXC濃度，并研究其在兔體內的毒代動力學過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：高效液相色譜儀為美國Agilent1100系列，包括G1322A在線脫氣機，G1311A四元泵，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測器，Agilent化學工作站（Rev A.08.03.[847]）。電子分析天平，渦旋混合器，恒溫水浴箱，臺式高速離心機等。

1.1.2 藥品與試劑：MXC（批號357-25，純度98%，北京明尼克分析儀器設備中心）；馬拉硫磷（批號5041-2168，純度99.2%，安捷倫科技有限公司）；乙腈（一級色譜純，德國默克公司）；乙酸乙酯，正己烷（色譜純，天津四友生物醫學技術有限公司）；甲醇（一級色譜純，天津四友精細化學品有限公司）；NaF（批號20051125，純度98%，上海三愛試劑有限公司）。

1.1.3 實驗動物：日本大耳兔5只，體重（3.0±0.22）kg，由溫州醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：浙醫動字第2203001號。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm，Agilent，USA），流動相為乙腈-水（70:30，V/V）。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：240 nm；參比波長：380 nm；檢測靈敏度：0.05 mAU；內標：馬拉硫磷。

1.2.2 血漿樣品預處理：準確吸取血漿1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入25 g·L-1NaF 100μL，靜置10min加入0.3 g·L-1馬拉硫磷內標液40μL，加乙酸乙酯-正己烷（4:1，V/V）萃取液2 mL，渦旋混勻后3000×g 離心10 min，取上層有機相1.8 mL于另一錐底試管中，37℃水浴條件下氮氣流吹干。用200μL流動相復溶，20μL進樣檢測。

1.2.3 標準曲線的制備：取9只10 mL具塞試管，加入空白血漿1.0 mL，25 g·L-1NaF 100μL，靜置10 min后，加入不同濃度的MXC標準液，配成濃度相當于0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 μg·mL-1的血漿樣品，按“1.2.2”項”方法處理后，測定MXC峰面積Ai和內標峰面積As，以Ai/As為縱坐標，以所對應各點濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線。

MXC的標準曲線回歸方程為血漿標準曲線：C=1.1573Ai/As-0.0245 (r=0.99993)；最低檢測限均為0.05 mg·L-1。

1.2.4 方法驗證：配制濃度分別為0.1、1.0和5.0 mg·L-1的MXC血漿標準品溶液，每個濃度平行5管，按文獻[7]考察本方法的回收率和精密度。

1.2.5 動物實驗：日本大耳兔5只，MXC用玉米油溶解灌胃，劑量為200 mg·kg-1，分別于給藥前和給藥后 5、10、20 min，1、2、4、6、9、 12、18、24 h，取靜脈血2 mL，注入肝素化的試管，3000×g離心10 min，取血漿，-40 ℃保存備測。

1.2.6 數據處理：實驗結果采用中國藥理學會數學藥理專業委員會編寫的DAS藥代動力學計算程序進行數據處理，用房室模型計算MXC的毒動學參數。

2 結果

2.1 方法驗證 圖1為空白血漿、MXC純標、MXC血標、及含MXC的血漿樣品經HPLC分析測定得到的色譜圖。由圖可見在本實驗條件下，MXC與內標馬拉硫磷能完全分離，沒有明顯的內生雜質峰干擾。內標的保留時間為3.4 min，MXC的保留時間為7.1 min。本方法具有較高的專屬性，回收率和精密度符合生物樣品分析指導原則的要求[8]（見表1）。

表1 回收率和精密度

圖1 MXC血漿色譜圖

圖2 MXC濃度時間曲線

2.2 MXC在兔體內的毒代動力學 200 mg·kg-1MXC一次性灌胃后， 兔血漿中MXC的濃度時間曲線見圖2。結果表明，MXC在兔體內的動力學過程呈雙峰現象。因目前DAS軟件無法擬合雙峰現象，將整個體內過程分為（0.083～4）h和（4～24）h兩個時間段處理，均符合一級動力學二室模型。主要的動力學參數見表2。

3 討論

MXC為重要的環境激素類農藥，可通過多種機制而產生生殖毒性，涉及氧化應激反應，擬雌二醇作用，對生殖細胞及胚胎的毒性及干擾神經、免疫系統的功能等[6]，已成為目前研究的熱點。因此有必要建立統一、合理、靈敏的檢測方法并開展毒代動力學研究，以了解MXC在動物體內血漿濃度變化的規律及其與各系統毒性作用的關系。目前MXC的檢測主要采用氣相色譜法和氣質聯用法[1-2，9]，用于環境、農產品、及生物樣品中微量農藥殘留的檢測，鮮見毒動學研究的報道。氣質聯用和氣相色譜檢測法靈敏度高，峰型好，能同時分辨多種農藥，但儀器和試劑的成本也高，樣品的前期處理復雜，對實驗條件要求的較高。因MXC的毒性較低，家兔急性經口半數致死量>2000 mg·kg-1[6]。可適當加大給藥劑量而獲得較高的血藥濃度，本實驗中給兔灌服200 mg·kg-1的MXC，除個別動物有輕微的中樞興奮外無其他異常中毒反應。因此本研究嘗試用HPLC法檢測血漿樣品中的MXC濃度，并進行整體動物的毒代動力學研究。

表2 MXC在家兔體內的藥動學參數

本研究中流動相采用乙腈和水，比例為70:30。在此條件下MXC與內標馬拉硫磷能完全分離，沒有明顯的內生雜質峰干擾。提高乙腈的比例可使MXC出峰時間提前，峰型也更好，但內標馬拉硫磷的出峰時間也提前，與血漿雜峰重疊；降低乙腈的比例可使MXC的出峰時間推遲，如比例為65:35時，MXC的出峰時間在10min左右，此時峰形變寬且與其后的雜峰有部分重疊。選擇內標時，考慮到MXC脂溶性的特點，嘗試了多種中樞抑制藥、有機氯及有機磷農藥，以馬拉硫磷的出峰時間及峰型最為理想，但馬拉硫磷在血漿樣品中易被膽堿酯酶水解，因此血漿需事先用NaF處理，抑制膽堿酯酶活性。在本色譜條件下，出峰時間適當，峰形干凈利落無干擾，而且所要求的預處理方法簡便快速，適合動物實驗中大量樣本的檢測。

毒代動力學研究表明，MXC 200 mg·kg-1灌胃后兔血漿中濃度的變化符合一級動力學二室模型；在給藥后18 min和6 h出現兩次峰濃度，分別為3.66和3.59 mg·L-1，雙峰間隔時間較長，提示可能存在肝腸循環；兩個時間段消除相半衰期分別為15.12和11.01 h，說明MXC一次性染毒后可在體內持續較長時間；MXC的血漿濃度較低，參照表2中V1、AUC及T1/2等藥動學參數分析，MXC吸收完全，表觀分布容積V1偏大，半衰期較長，因此其濃度偏低的原因可能主要是在組織中有較多的蓄積。MXC為低毒類有機氯農藥，對人畜毒性小、使用安全，臨床未見有急性中毒的報道，但其毒動學特點表明MXC在體內蓄積所致的慢性毒性仍需重視。

[1] 余彬彬,秦榜輝,牟義軍,等. 氣相色譜-串聯質譜多離子監測分析土壤中的有機氯農藥殘留[J].分析試驗室,2008,27(增刊):191-195.

[2] 陳明,任仁,王子健,等. 北京工業廢水和城市污水中有機氯農藥殘留分析[J].中國環境監測,2007,23(4):29-32.

[3] Murono EP, Derk RC, Akugl Y. In vivo exposure of young adult male rats to methoxychlor reduces serum testosterone levels and ex vivo Leydig cell testosterone formation and cholesterol side-chain cleavage activity[J]. Reprod Toxicol,2006,21(2):148-153.

[4] Amstislavsky SY, Amstislavskaya TG, Amstislavsky VS, et al.Reproductive abnormalities in adult male mice following preimplantation exposures to estradiol or pesticide methoxychlor[J]. Reprod Toxicol, 2006, 21(2):154-159.

[5] Amenti AE, Zama AM, Passantino L, et al. Developmental methoxychlor exposure affects multiple reproductive parameters and ovarian folliculogenesis and gene expression in adult rats[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2008,233(2):286-296.

[6] 常飛,陳必良. 環境激素類農藥甲氧滴滴涕生殖毒性研究進展[J].國外醫學:衛生學分冊,2007,34(2):70-74.

[7] 周紅宇,陳醒言,黃成珂,等.冰片對卡馬西平在小鼠體內分布的影響[J]. 溫州醫學院學報, 2008,38(4):300-305.

[8] U.S. Food and Drug Administration, Centre for Drug Evauation and Research(CDER). Guidance for industry,bioanalytical method validation[EB/OL]. 2001[2009-08-02]. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf.

[9] 夏俊鵬,吳飛,劉紅亞. 工作場所空氣中甲氧滴滴涕的氣相色譜測定方法研究[J].中國衛生檢驗雜志,2007,17(4):588-600.