利用SELDI-TOF-MS技術分析喉癌患者血清蛋白質譜變化

王秀麗,高春芳,趙 光,盛新華

(解放軍第150中心醫院全軍肛腸外科研究所,河南洛陽 471031)

利用SELDI-TOF-MS技術分析喉癌患者血清蛋白質譜變化

王秀麗,高春芳,趙 光,盛新華

(解放軍第150中心醫院全軍肛腸外科研究所,河南洛陽 471031)

目的篩選喉癌特異性血清蛋白質標志物,建立用于喉癌診斷的分類樹模型。方法采集喉癌患者57例與正常人64例的血清,用表面增強激光解吸/電離-飛行時間-質譜分別檢測其蛋白表達譜,用Biomarker Wizard軟件篩選出差異蛋白,再用Biomarker Patterns軟件建立喉癌診斷模型,另采集15例喉癌患者及20名正常人的血清對該模型進行盲法驗證。結果通過對喉癌患者術前血清與正常人血清蛋白質譜分析,發現有24個蛋白的表達有明顯差異(P＜0.05),并建立了由質荷比(M/Z)分別為4 206、6623、8 928和9 424 Da的4種蛋白質組成的分類樹診斷模型,準確率為95.0%(115/121),敏感性和特異性分別為94.7%(54/57)、95.3%(61/64)。盲法驗證其敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。分析喉癌患者手術前后血清蛋白質譜的變化,發現術前高表達的8種蛋白質術后表達明顯下調。結論喉癌血清蛋白質譜診斷模型具有一定的優越性,為喉癌的早期診斷及預后標志物的篩選提供了新途徑。

喉癌;SELDI-TOF-MS;生物學標記;質荷比(M/Z)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1437)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,近年來其發病率有增高的趨勢。喉癌的定位診斷較容易,但在喉癌的早期診斷上仍缺乏有效的生物標志物。近年來腫瘤的蛋白質組學研究取得了長足的進展,尤其是表面增強激光解吸/電離-飛行時間-質譜(Surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術的出現為尋找腫瘤的生物標志物提供了新的技術平臺[1]。本研究通過對喉癌患者與正常人血清差異蛋白的比較,建立了喉癌的血清蛋白質譜診斷模型。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組喉癌病人57例(聲門癌22例、聲門上癌28例、聲門下癌7例),年齡40-72歲,中位年齡57.45歲。其中男性31例,女性 26例。血清標本取自2007年2月-2008年12月在解放軍第150中心醫院住院的手術患者,均經術后病理確診,均為不同分化階段的鱗狀細胞癌。正常對照組血清標本64例,取自同期本院健康體檢人群。所有病人術前及術后15天清晨空腹無菌采靜脈血3 ml,1 000 rpm離心,收集上清分裝,-80℃保存。病人組與對照組在性別構成和年齡上無統計學差異。并且三類標本均經實驗室檢查排除影響血清蛋白質含量的其它相關疾病。

1.2 試劑與儀器

尿素、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)、三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)、3-環乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)及羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等均購自美國Sigma公司。SELDI蛋白質芯片系統(PBSⅡ-C)及其配套的金屬親和表面(IMAC30)銅離子芯片均購自美國Ciphergen公司。

1.3 方法

1.3.1 血清樣品準備 4℃融解血清,1 000 rpm離心10 min;取20 μ l血清,置于1.5 ml離心管中 ;加40 μ l U9 緩沖液(含 9 mol/L尿素 、2%CHAPS 、50mmol/L Tris-HCl,pH9.0);4℃振蕩 30 min,使蛋白變性;取20 μ l變性后的樣品 ,加入 240 μ l IMAC 結合/洗脫緩沖液(含100 mmol/L磷酸鈉、500 mmol/L氯化鈉,pH7.0)中,使最后上樣的血清稀釋約40倍。

1.3.2 芯片預處理及與血清蛋白結合 芯片每孔加100 mmol/L硫酸銅溶液50 μ l,4℃下200 rpm振蕩5 min,去除硫酸銅溶液,用去離子水洗滌5次后甩干;每孔中加入100 mmol/L醋酸鈉(pH4.0)50 μ l,4℃振蕩5 min,去離子水洗滌5次;芯片每孔加入結合/洗脫緩沖液150 μ l,4℃振蕩 5 min后除去緩沖液,重復1次。將稀釋后的樣品取50 μ l加入芯池中,4℃孵育60 min后棄去液體;再用150 μ l結合/洗脫緩沖液沖洗 2次;最后用 1 mmol/L HEPES(pH7.0)快速沖洗。取出芯片,自然風干。在各孔芯池上加入飽和 SPA(取SPA1 mg溶于 15 μ l 50%ACN 、15 μ l 1%TFA 中)2 次 ,每次為 0.5 μ l。風干后上機檢測。

1.3.3 芯片檢測與數據處理 用加有All-in-one標準蛋白質的NP20芯片校正質譜儀,設定儀器參數。檢測時設定SELDI-TOF-MS的激光強度為175,靈敏度為8,收集數據的質荷比(M/Z)范圍為2 000-20 000,收集位置 25-75。用 Ciphergen ProteinChip 3.2.0軟件自動采集數據,用Biomarker Wizard 3.2.0軟件對芯片檢測得到的蛋白質相對含量及蛋白質M/Z數據進行處理。

1.3.4 分類樹診斷模型的建立 用數據挖掘軟件Biomarker Patterns Software 5.0對所得數據分組及相關性進行分析。建立用于喉癌與正常人的最優分類樹診斷模型。觀察該模型的診斷效能。

2 結果

2.1 喉癌術前組與正常對照組血清樣品蛋白質譜的比較

2.1.1 血清蛋白質譜的比較 用Biomarker Wizard軟件對57例喉癌患者(術前)和64例正常人的血清蛋白質譜數據進行對比分析,喉癌組與對照組血清樣品中有半數蛋白峰的表達量都是基本相同的,但2組之間仍有24個蛋白表達差異具有統計學意義。其中有19個蛋白峰在喉癌組(術前)與對照組比較,差異顯著(P＜0.01)。在這19個蛋白中,喉癌組血清中高表達的蛋白占16個;與正常對照組相比較,蛋白表達下調的有3個,表1。

2.1.2 喉癌診斷模型的建立 用Biomarker Patterns軟件對檢測得到的數據進行數據挖掘,建立了M/Z分別為4 206、6 623、8 928和 9 424等4種蛋白組成的最優分類樹診斷模型,圖1。該模型中節點1為根節點,包括了所有用于建立模型的受檢樣本。各節點處的判別函數(各系數與括號內相應蛋白質相對含量的積)分別為:在節點 1處如 -0.565(M4206)-0.825(M8928)≤-7.687,歸節點 2,否則為節點4。節點2處如 M9424≤2.252歸節點3,否則為終結點3。節點3處如 0.684(M4206)-0.729(M6623)≤2.438歸為終節點1,否則歸為終結點2。節點4處如M8928≤-0.075歸為終結點4,否則為節點5。節點5處如M4206≤-1.652歸為終結點5,否則為終結點6。終結點1、6被模型判別為正常人 ,終結點 2、3、4、5 為喉癌 。

2.1.3 分類樹模型對喉癌的診斷效率 分類樹模型在學習模式下對57例喉癌患者、64例正常人進行分組,準確率為96.7%(117/121),靈敏度和特異性分別為96.5%(55/57)、96.9%(62/64);在測試模式下對上述樣本進行分組,其準確率為94.2%(114/121),靈敏度和特異性分別為94.7%(54/57)、93.8%(60/64)。利用所建立的最優分類樹診斷模型驗證另外15份喉癌和20份正常對照樣品的血清蛋白圖譜,敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。

2.2 喉癌術前與術后血清蛋白質譜的變化

在相同條件及參數下,應用IMAC30蛋白芯片和Biomarker Wizard軟件對喉癌術后病人血清分析,并與術前組和正常對照組的蛋白質譜進行對比研究。結果發現術前組19種高表達的蛋白在術后有14種蛋白表達量都有所下降,其中M/Z為6 960、4 206、8 518、13 876、6 960、9 424、14 052、3 910 等 8 種蛋白與正常對照組蛋白峰強度相當,無顯著差異,而與術前組比較具有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 喉癌組與對照組血清蛋白圖譜分類樹模型

表1 喉癌組和對照組血清質譜中差異蛋白表達的比較

3 討論

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,發病率約占全身惡性腫瘤的5%[2]。聲門型喉癌由于在病程早期就出現聲音嘶啞,因此可較早發現病變,聲門上癌或聲門下癌因早期癥狀不明顯,易延誤診斷,治療效果差,有時很難保留喉功能。因此,喉癌的早期診斷不僅可以徹底切除腫瘤,而且為保留或重建喉功能提供了機會。而從血清中尋找特異性生物標記物用于喉癌的早期診斷是目前的研究熱點之一。血清中低分子量蛋白質譜可反映出喉癌各個不同階段的病理變化,通過對血清標本進行蛋白指紋圖譜分析,可能有助于喉癌的早期診斷。

SELDI-TOF-MS技術是蛋白質芯片技術與質譜技術相結合的產物,最先由Hutchens和Yip[3]提出,自Adam、Petricoin等[4,5]將其應用于前列腺癌、卵巢癌的研究以來,已被廣泛應用于臨床常見惡性腫瘤[6]的研究。該技術在耳鼻咽喉頭頸外科方面也有相關的研究。Wadsworth等[7]應用SELDI-TOF-MS技術在99例頭頸部鱗狀細胞癌患者、25例健康抽煙者及102例正常對照的血清中篩選差異表達蛋白,結果發現33個蛋白質峰與正常組有顯著差異。其中相對分子質量為10 068的峰被鑒定為已知腫瘤標記物MPS1。國內肖雪媛等[8]對33例喉癌患者和31例正常人血清應用蛋白芯片進行蛋白質譜分析比較,喉癌患者中有16個差異蛋白(標志分子),其中8個標志分子在喉癌患者中高表達,得出兩個相對分子質量8135和2053的蛋白質用于建立喉癌診斷的分類模型。張秀強等[9]對46例喉癌患者血清進行蛋白指紋圖譜與正常人比較,結果表明用該技術初步建立的區分喉癌與正常人血清蛋自差異表達模型可以區別喉癌和正常人,同時篩選出喉癌特異相對分子質量4174、5192和4965的蛋白。

本研究采用SELDI-TOF-MS技術對57例喉癌病人和64名正常人進行了血清蛋白質譜對比分析研究,發現喉癌病人與正常人血清中有24個蛋白質峰具有顯著差別(P＜0.05)。將兩組血清蛋白質譜建立數據庫,利用Biomarker Patterns軟件建立了以M/Z分別為4 206、6 623、8 928和 9 424等4種蛋白組成的分類樹診斷模型,將喉癌病人與正常人正確分組,其正確分組率分別為94.7%(54/57)和95.3%(61/64)。用此模型盲法分析另外15例喉癌患者和20例健康人的血清蛋白質譜,敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。喉癌病人手術前后血清蛋白質譜比較發現,一些手術前高表達的蛋白質在術后均明顯下降,其蛋白質峰強度與正常對照組相當。

我們的研究結果表明,通過SELDI-TOF-MS技術所建立的喉癌的診斷模型具有重要的臨床意義,還可以利用該技術進一步篩選預后標志物。也要看到,SELDI-TOF-MS做為質譜的一種,有其自身的劣勢,如不適用于大分子量的蛋白質的分析。同時,由于血清蛋白質具有巨大的動態變化范圍(＞1010),而我們研究的樣本數量有限,對于蛋白質組學在評價喉癌治療效果中的應用,還需要進一步的深入。

[1]Vermza M,Wright GL,Hanash SM,et al.Proteomic approaches within the NCI early detection research network forthe discovery and identificationof cancer biomarkers[J].Ann N Y Acad Sci,2001,945:103.

[2]Sanderson RJ,Ironside JAD.Squamous cell carcinoma of the head and neck[J].B MJ,2002,325:822.

[3]Hutchens TW,Yip TT.New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules[J].Rapid Commun Mass Spectrom,1993,7:576.

[4]Adam BL,Qu Y,Davis JW,et al.Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men[J].Cancer Res,2002,62:3609.

[5]Petricoin EF,Ardekani AM,Hitt BA,et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet,2002,359:572.

[6]Azad NS,Rasool N,Annunziata CM,et al.Proteomicsin clinical trials and practice:present uses and future promise[J].Mol Cell Proteomics,2006,5:1819.

[7]Wadsworth JT,Somers KD,Cazares LH,et al.Serum protein profiles to identify head and neck cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10:1625.

[8]肖雪媛,趙小冬,劉劍凱,等.利用蛋白質組學方法篩選及確定喉癌診斷的標志分子[J].中國科學C輯生命科學,2004,34:49.

[9]張秀強,陳 瑛,王巾幗,等.表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜血清蛋白指紋圖譜在喉癌診斷中的應用[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20:842.

Analysis of serum protein spectra in patients with laryngeal carcinoma by SELDI-TOF-MS

WANGXiu-li,GAO Chun-fang,ZHAOGuang,et al.(Institute of Anal-colorectal surgery,150th Central Hospital of PLA,Luoyang471031,China)

ObjectiveTo explore the distinct expression of serum protein biomarkers of laryngeal carcinoma and create a decision classification tree model for diagnosing laryngeal carcinoma.MethodsSerum samples from 57 laryngeal carcinoma patients and 64 health people were collected and their serum protein fingerprinting were read by surface enhanced laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS).The Biomarker Wizard and Biomarker Patter software were used to screen and analyze the distinct proteins between the two groups.The best classification tree model was created for diagnosing laryngeal carcinoma.Then the model was blindly validated using another group of serum samples(15 from laryngeal carcinoma and 20 from healthy).ResultsTwenty-four distinct proteins of statistical significance were found between the sera from patients of laryngeal carcinoma pre-operation and healthy people(P＜0.05).The best decision classification tree model was successfully established,which included 4 kinds of proteinswith the mass-to-charge ratio 4206,6623,8 928 and 9 424Da.The accuracy of diagnosis was 95.0%(115/121),the sensitivity and specificity were 94.7%(54/57)and 95.3%(61/64),respectively.Blind test generated a sensitivity of 86.7%(13/15)and a specificity of 85.0%(17/20).Furthermore,the eight proteins over-expressed in serum from pre-operationwere obviously downregulated after operation.ConclusionThe diagnostic modelof serum fingerprinting is useful and offers a new approachfor early diagnosing laryngeal carcinoma and screening prognostic biomarkers.

laryngeal carcinoma;SELDI-TOF-MS;biological markers;mass-to-charge ratio(M/Z)

R739.65

A

1007-4287(2010)09-1437-04

book=1440,ebook=509

2009-11-20)