燒傷創面內表皮生長因子、表皮生長因子受體、C-myc三種基因表達變化的臨床觀察

谷廷敏,谷 陽,隋志甫,劉靜杰,趙志力*

(1.中國人民解放軍北京軍區總醫院全軍皮膚病診治中心整形美容中心,北京 100125;2.中國西南財經大學統計學院,成都 610074)

燒傷創面內表皮生長因子、表皮生長因子受體、C-myc三種基因表達變化的臨床觀察

谷廷敏1,谷 陽2,隋志甫1,劉靜杰1,趙志力1*

(1.中國人民解放軍北京軍區總醫院全軍皮膚病診治中心整形美容中心,北京 100125;2.中國西南財經大學統計學院,成都 610074)

目的為探討燒傷創面愈合機理,了解燒傷創面內表皮生長因子基因、表皮生長因子受體基因和C-myc基因的變化,為臨床治療提供依據。方法我們對25例病人燒傷創面的不同部位應用原位雜交方法,觀察表皮生長因子基因、表皮生長因子受體基因和C-myc基因在燒傷創面肉芽中心部(肉芽中心部)、肉芽與愈合皮膚的交界部(創面交界部)、愈合皮膚部位(創面愈合部)和自身正常皮膚對照部位內表達強度和分布的特點。結果同一部位燒傷創面內,表皮生長因子基因和C-myc基因在交界部表達最強;燒傷創面中心部位表達次之,燒傷創面愈合部位表達較弱;表皮生長因子受體基因表達在創面中心部位表達較強,在表達交界部次之;在創面愈合部表達較弱;正常皮膚對照部位三種基因表達不明顯。結論燒傷創面內表皮生長因子基因、表皮生長因子受體基因和C-myc基因在燒傷創面內有明顯的規律性表達,表達與創面愈合密切相關。

燒傷創面;表皮生長因子基因;表皮生長因子受體基因;C-myc原癌基因;原位組織雜交

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1431)

創面愈合過程中多種生長因子和其相關基因表達對愈合產生很大的作用,研究這些變化對了解創面修復機理和促進臨床治療均有意義。既往我們報道過動物創面愈合過程中表皮生長因子(EGF)基因、表皮生長因子受體(EGFr)基因和臨床供皮區創面愈合中C-myc原癌基因的表達變化,提示了創面愈合中上述三種基因的表達變化可能與創面修復過程明顯相關[1-3]。為了解其變化的普遍意義,我們又觀察了臨床燒傷創面中上述三種基因的表達變化,探討其意義,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組病人25例,男18例,女7例。平均年齡35.3歲。平均燒傷面積23.4±6.2%TBSA。

1.2 標本留取 征求病人同意后,創面植皮手術時分別切取燒傷創面不同部位標本:包括創面肉芽中心部(簡稱創面中心部)、肉芽與愈合皮膚的交界部(簡稱創面交界部)、愈合皮膚部位(簡稱創面愈合部)和遠離創面的自身正常皮膚作為對照部位;標本切取是用眼科角膜環鉆切取包括創面、創基及少量皮下脂肪在內的標本1 cm3,置于4%的多聚甲醛液固定待用。

1.3 原位組織雜交方法 將留取的標本置于4%的多聚甲醛液固定,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切成5 μ m的組織切片,用地高辛標記C-myc原癌基因和EGF、EGFr的cDNA探針后進行組織切片的原位雜交:組織切片脫蠟入水,0.2 mol/L鹽酸酸化,蛋白酶K消化,酒精脫水,置預雜交液(42℃)預雜交4 h,入雜交液雜交(42℃)17 h后用 Boegringer Mannheim公司產品Dig-DNA labelling and detection試劑盒觀察切片中C-myc、EGF和 EGFr活化表達的mRNA的變化情況,以確定創面愈合中C-myc原癌基因、EGF基因、EGFr基因表達狀況。400倍光鏡下測定其相對含量,以所見視野內無陽性細胞為陰性,連續記數5個視野,求出每個視野內陽性細胞數,當視野內有10個以下陽性細胞時,表達強度確定為弱陽性(+);當視野內有11-20個陽性細胞時,表達強度確定為中等陽性(++);當視野內有21個以上陽性細胞時,表達強度確定為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件處理組間變化,進行方差分析;P值＜0.05,表示差異有統計學意義。

2 結果

光鏡下組織學所顯示的地高辛標記C-myc、EGF和EGFr的cDNA探針所進行的原位雜交陽性細胞結果為分布于細胞漿或少量的胞核內的藍紫色細顆粒。正常皮膚內無明顯的陽性細胞。同一燒傷創面部位EGF基因和C-myc基因表達較為一致,主要在創面交界部位表達最強,創面的中層和深層均可見到陽性細胞,陽性細胞主要表達在成纖維細胞胞漿和創緣上皮基底細胞胞漿,少量還有在血管內皮細胞和皮膚附屬上皮細胞中,密集分布,表達強度(++-+++),每個視野內EGF基因和C-myc基因陽性細胞數分別為23.60±3.23和25.50±4.6;創面中心部位表達次之,每個視野內EGF基因和C-myc基因陽性細胞數分別為12.30±1.23和14.61±2.6,表達強度在(+-++);創面愈合部位表達較弱,每個視野內EGF基因和C-myc基因陽性細胞數分別為5.40±1.23和7.52±1.70,表達強度在(+)左右。EGF基因和C-myc基因在以上各部位表達差別:P均＜0.05,有統計學意義。

EGFr基因表達部位與前兩者不同,主要在創面中心部位表達較強,表達強度在(++-+++),每個視野內陽性細胞數為28.52±5.6,表達細胞也主要分布在創面內的成纖維細胞、創緣上皮基底細胞胞漿,還有血管內皮細胞和皮膚附屬上皮細胞中,多較密集分布,創面的中層和深層多見到陽性細胞;在創面交界部位EGFr基因表達較創面中心部位表達次之,表達強度在(+-++),每個視野內陽性細胞數分別為16.32±2.0,而在創面愈合部位表達更弱,表達強度(+),每個視野內陽性細胞數分別為9.12±0.60,主要分布在創面淺層的成纖維細胞、上皮基底細胞胞漿內。EGFr基因在以上各部位每視野內陽性細胞數量差異,P值均＜0.05,有統計學意義。EGF、C-myc、EGFr三種基因在創面內表達變化見表1。

表1 EGF、C-myc、EGFr三種基因在創面內表達變化

3 討論

創傷修復是機體對外來損傷刺激而引起的一系列信號反應,其最終目的是達到對損傷的修復,其中包括組織細胞的遷移增殖、肉芽組織的形成、細胞外基質沉積、再上皮化過程。創傷修復可以至少分為三個連續或者重疊的時期:炎癥反應期、增值修復期和組織重塑期,各期均有創傷部位釋放的多種生長因子調控促進修復;這些細胞因子如果調控失常會干擾正常的組織修復過程而出現愈合過慢形成潰瘍或者愈合過度形成瘢痕[4]。組織損傷后局部發生許多重疊的生物、化學和細胞學反應、首先是局部血小板凝聚形成血塊,炎性細胞如:中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等的侵入進行清創,巨噬細胞和成纖維細胞釋放多種生長因子進行修復。巨噬細胞是創傷修復早期局部生長因子的主要來源,這些生長因子及其相關基因對組織的修復、調控發揮了很大作用[5],EGF、EGFr基因在調控組織細胞的增殖方面有很重要的作用,各種刺激引起EGF、EGFr基因表達后,組織中相應的細胞因子增多,從而促進細胞分裂增殖和創傷的愈合[6、7]。

C-myc原癌基因在調控組織細胞的增殖方面有很重要的作用,各種刺激引起C-myc原癌基因表達后,可以促進細胞由靜止期(G0期)而進入分裂期(S期),促進細胞的分裂增殖。C-myc原癌基因表達的蛋白定位于細胞核,與產物定位于胞膜的一類癌基因(如ras基因)協調轉化細胞,最終使細胞進入S期,C-myc基因參與了此過程并起重要作用,尤其是細胞從Go期進入G1期的過程,因此,C-myc原癌基因表達被人們看作是細胞有絲分裂的中介物[8、9]。

本研究表明:同一部位燒傷創面內表皮生長因子基因和C-myc基因在創面交界部位表達最強,燒傷創面中心部位表達次之,燒傷創面愈合部位表達較弱;而EGFr基因表達在創面中心部位表達較強,在創面交界部位次之,在創面愈合部位表達較弱。從組織學可以看到:創面愈合過程中創面交界部位是創面的再上皮化前沿部位,此部位創緣和創基增殖很明顯,而在創面中心部位創緣和創基的增殖雖不明顯,而此時 EGFr基因表達可能有助于細胞EGFr蛋白的合成,細胞高含量的敏感EGFr又有助于細胞結合EGF蛋白,發揮EGF生物效應。從組織學時相上看,創面中心肉芽部位、創面愈合交界部位和創面愈合部位應該是創面愈合的連續過程,EGFr基因在創面中心部位表達最強,而EGF基因和C-myc基因在創面交界部位表達最強有積極的生物學意義,EGFr基因早于EGF基因和C-myc基因的高表達更體現了組織細胞在為明顯的宏觀修復做好生理和生化方面的準備,創緣處細胞增殖組織修復旺盛,EGF、C-myc基因高強度表達,表明了這些生物因子對促進創緣處細胞增殖組織修復旺盛的作用;而創面愈合部位,雖然細胞增殖仍在旺盛進行,而EGF、EGFr、C-myc基因表達均明顯減弱,這些基因表達變化可能與避免組織的過度修復相一致,也有積極意義。從表達的細胞可看出 EGF、EGFr、C-myc原癌基因多表達在創緣和創基的成纖維細胞、血管內皮細胞、皮膚附屬上皮細胞,這些部位和細胞的 EGF、EGFr、C-myc原癌基因生物因子的高表達也提示了對組織修復的積極意義。

Leeni等報道:組織損傷后包括多種生長因子:如EGF、TGF-a、TGF-b,KGF 等通過激活 EGFr引起細胞遷移加快、細胞分裂增速,促進了組織愈合修復,而應用了EGFr抑制物就拮抗了這些生長因子的促修復作用[10]。從而證實了EGFr基因在創傷修復對介導多種生長因子的作用起很重要的調節作用。我們的實驗證明:燒傷創面內EGF基因、EGFr基因、C-myc原癌基因有明顯的規律性表達,提示了對介導多種因子促進細胞分裂增殖和創面愈合有重要作用。深入細致的研究,保持內源性分泌的生長因子和相關基因的表達以及結合外用方法達到促進創面修復的最佳狀態,將會對促進組織修復產生很大的意義。

[1]谷廷敏,牛星燾,陳東明.創面愈合過程中EGFr基因表達的研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志,1996,2:206.

[2]谷廷敏,牛星燾,陳東明.創面愈合過程中 EGF基因表達的研究[J].中國修復重建外科雜志,1996,3:13.

[3]谷廷敏,李 文,隋志甫,等.臨床修復中c-myc原癌基因表達變化的觀察[J].中國康復雜志,2004,8(2):266.

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[10]Leeni Koivisto,guoqiao Jiang,Lari Hakkinen,et al.HaCat Keratinocyte migration is dependent on epidermal growth factor receptor signaling and glycogen synthase kinase-3a[J].Experiment Cell Research,2006,312:2791.

The observation of EGF gene,EGFr gene and C-myconcongene expression in the burns wound

GU Ting-min,GUYang,SUI Zhi-fu,et al.(The General Hospital of Beijing Command of PLA,Beijing100125,China)

ObjectiveTo detect the changes of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene expressionsin the wound healing of the burn patients.MethodsEGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the granulation center part of the burnwound(center part),the edge part between the granulation part and healed part of the burn wound(edge part),the healed part of the burn wound(healed part)and normal skin as control are detected by In situ Hybridization method.ResultsThere are remarkely regular expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene in the burn wound,the most obviously expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the edge part of the burn wound,more expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the center part of the burn wound and some expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the healed part of the burnwound.the most obviously expression of EGFr gene expression is in the center part of the burn wound,more expression of EGFr gene expression is in the edge part of the burn wound and some expression of EGFr gene expression is in the healed part of the burnwound,there is no obviously expression of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene in the normal contral skin.Conclusionthe expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the burns wound are closely relately to the wound healing,Their expression has important roles in the burns wound healing.

EGF gene;EGFr gene;C-myc concongene;Burn Wound;In situ hybridization

R644

A

1007-4287(2010)09-1431-03

國家自然科學基金資助課題(30973123)

*通訊作者

谷延敏,男,50歲,博士,副主任醫師,北京軍區總醫院全軍皮膚病診治中心整形美容中心主任。主要研究方向:創傷修復與組織移植。

2009-11-27)