兩例Y染色體嵌合體核型合并Y染色體微缺失病例分析

戴汝琳,王瑞雪,張志紅,董 媛,劉睿智,李付彪

(1.吉林大學第一醫院 生殖醫學中心,吉林 長 春 130021;2.吉林大學第一醫院 男科,吉林 長 春 130021)

兩例Y染色體嵌合體核型合并Y染色體微缺失病例分析

戴汝琳1,王瑞雪1,張志紅1,董 媛1,劉睿智1,李付彪2*

(1.吉林大學第一醫院 生殖醫學中心,吉林 長 春 130021;2.吉林大學第一醫院 男科,吉林 長 春 130021)

目的報道兩例染色體嵌合體合并Y染色體微缺失的男性無精子癥患者。方法利用細胞遺傳學核型分析染色體核型;PCR技術檢測外周血AZF、SRY基因及血清生殖激素檢查為輔助檢查。結果核型分析確定兩例患者均為嵌合體,一例為46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19∶41。SRY基因存在,但 Y染色體 AZFc、d區 sY152,sY157,sY254,sY255位點缺失。激素水平:高促卵泡激素,高黃體生成素,睪酮水平下降;一例為46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。SRY基因存在,AZFb、c、d區sY127,sY152,sY157,sY254,sY255位點缺失。激素水平:高黃體生成素,睪酮水平下降。結論Y染色體上AZFc和AZFd區上的基因可能與Y染色體穩定性相關,染色體嵌合體患者有必要進行Y染色體微缺失檢測。

無精子癥;染色體嵌合體;AZF

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1393)

精子發生是指從生精上皮的干細胞發育到成熟精子的一系列復雜變化過程,受多個基因調控[1]。其中任何一環節異常均可導致男性不育。Y染色體長臂上存在與精子發生相關的基因,即無精子因子(azoospermia factor,AZF),AZF可劃分為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四個區域,對精子生成起十分重要的作用。

近年來有證據表明,男性不育尤其是無精子癥或嚴重少精子癥的發生與遺傳因素有關,主要與Y染色體微缺失和染色體異常有關。在目前的文獻報道中,Y染色體微缺失的頻率為0.4%-55%,大約10%-15%無精子癥患者和5%-10%嚴重少精子癥患者存在Y染色體微缺失[2]。在男性不育患者中染色體異常發生率為2%-5%,在無精子癥中更高達15%[3]。本文報道2例染色體嵌合體合并Y染色體微缺失的患者,對其進行整理分析如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

患者1:男,29歲,因婚后不育而就診。患者體征正常,自述結婚七年,夫妻生活正常而妻未曾受孕,其父母非近親婚配,有十年吸煙史,工作環境接觸噪聲和振動。睪丸左右側均2 ml,質地軟。超聲提示:前列腺實質回聲,不均勻。CASA精液分析顯示:未見精子,白細胞4-5/HP。

患者2:男,33歲,因婚后不育而就診。患者體征正常,自述結婚三年,妻未曾受孕,夫妻性生活時間短,其父母非近親婚配,左側精索靜脈曲張術后。睪丸左右側均12 ml,質地軟。有雙側乳腺發育。CASA精液分析顯示:未見精子。

1.2 方法

1.2.1 血清生殖激素檢查 放射免疫分析法測定血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)、睪酮(T)水平。試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司,操作按試劑盒說明進行。正常參考值如下:FSH:0.8-15 mIU/ml;LH:0.4-6.8 mlU/m1;PRL:70-480 μ IU/ml;E2:10-100 pg/ml;T:3.2-15.6 ng/ml。

1.2.2 染色體核型檢查 取外周血進行淋巴細胞培養后,常規制備染色體標本,G顯帶分析計數30個中期分裂相,分析3-5個核型,異常者加倍計數、分析,結果按人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN,1985)進行表達。

1.2.3 Y染色體微缺失檢測 引物設計:10對檢測位點為:sY84、sY86、sY127、sY134、sY143、sY157、sY254、sY255、sY152和SRY。ZFX/ZFY為內控引物。9對引物和內控引物設計同文獻[4]。SRY引物序列 PrimerF:5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGAG-3′,Primer R:5′-ACCTGTTGTCCAGTTGCACT-3′,SRY 基因擴增片段長度為419 bp。(引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

提取外周血DNA:抽取患者外周血2ml,EDTA抗凝,用酚-氯仿抽提法常規提取全血基因組DNA。PCR擴增及電泳分析:設置正常男性陽性對照、女性陰性對照、水為空白對照。PCR總反應體系10 μ l,在AmplitronⅡPCR儀上完成PCR擴增反應。反應條件是:預變性94℃6 min,變性 94℃40 s,55℃45 s,72℃60 s,35個循環;72℃最后延伸6 min。PCR反應結束后,取出PCR產物,加6×上樣緩沖液1-2 μ l。混勻后點樣于 1.5%瓊脂糖凝膠(0.5 μ g/ml EB),80v電泳35 min。紫外透射儀觀察結果,記錄電泳結果并拍照。

結果判斷:當PCR反應后的電泳結果在目的基因片段長度上有擴增顯帶出現,陽性對照正常顯帶,陰性對照未見顯帶,確認該基因位點存在;電泳結果未見擴增基因顯帶,且重復3次(及以上)PCR擴增后仍無目的顯帶出現,而對照基因能正常顯帶,此時判定該基因位點缺失。

2 結果

2.1 血清生殖激素檢查

患者1:睪酮(T):1.70 ng/ml↓;促卵泡激素(FSH):17.00 mIU/ml↑;黃體生成素(LH):12.50 mIU/ml↑;催乳素(PRL):370.00 μ IU/ml;雌二醇(E2):31.50 pg/ml。

患者2:睪酮(T):2.50 ng/ml↓;促卵泡激素(FSH):12.00 mIU/ml;黃體生成素(LH):7.20 mIU/ml↑;催乳素(PRL):210.00 μ IU/ml;雌二醇(E2):66.00 pg/ml。

2.2 染色體核型分析

患者1:兩次染色體核型分析均顯示46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19∶41。圖 1顯示G 顯帶原圖結果,圖A',B'分別顯示對A,B分析后的圖示。

圖1 患者1的染色體核型分析結果(A與A':47,XXdel(Y)(q11)核型;圖 B與 B':46,XX核型)

患者2:兩次染色體核型分析均顯示46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。圖2顯示G顯帶原圖結果,圖C',D'分別顯示對C,D分析后的圖示。

圖2 患者2的染色體核型分析結果(C與C':46,XY核型;圖D與 D':45,X核型)

2.3 Y染色體微缺失檢測

患者1:sY152、sY157、sY254、sY255 位點缺失,SRY基因存在。本患者進行3次PCR擴增,結果均相同,陽性對照有顯帶,陰性對照和空白對照都沒有顯帶,證明這 3次實驗的可靠性。檢測結果見圖3A。

患者 2:sY127、sY152、sY157、sY254、sY255 位點缺失,SRY基因存在。同上,檢測結果見圖3B。

圖3 患者1 PCR電泳結果(A),患者2 PCR電泳結果(B)

3 討論

染色體核型異常可由親代遺傳或子代新生突變而發生。具有兩種或兩種以上細胞系的個體稱為嵌合體。嵌合體發生原因是正常精子和卵子受孕形成合子。合子細胞最初是正常的,但在以后的某次有絲分裂時發生了細胞分裂而染色體不分離,導致染色體數目異常而在體內形成三種細胞核型,一種細胞中含有正常數目的染色體,一種細胞中含有47條染色體(稱為三體細胞),而另外的一種細胞種含有45條染色體(稱為單體細胞)。因為單體型個體細胞中缺少一條染色體將造成基因組嚴重失衡,所以在常染色體單體型中,即使是最小的2l、22號染色體單體型病例也難以存活。本文患者均為嵌合體個體,一例患者核型為克氏征嵌合型,一例核型為單體細胞和正常細胞嵌和。一般認為嵌合體患者的臨床癥狀在很大程度上取決于異常細胞與正常細胞比例。異常核型細胞數目越多,對表型和功能的影響越嚴重。

克氏綜合征亦稱為先天性曲細精管發育不全,是一種性染色體異常所致的疾病,是臨床最常見的男性性腺功能低下疾病,系高促性腺激素性腺功能低下。其典型染色體核型為47,XXY;非典型染色體核型為 48,XXXY、49,XXXXY;嵌合型如 46,XY/47,XXY、46,XX/47,XXY等。本文患者嵌合克氏征核型是46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19:41。此類核型患者在臨床上多表現為性別分化異常,本例查體未見兩性畸形,僅為小睪丸,SRY基因存在,但患者有Y 染色體 AZFc、d 區 sY152、sY157、sY254、sY255 位點缺失。有文獻顯示非嵌合克氏征患者精液中有精子檢出[5][6],多表現為高FSH、高LH,而T下降。本文嵌合克氏征患者精液離心未見精子,也表現為高FSH,高 LH,而 T 下降。

另一例嵌合體患者核型是46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。本例患者還有Y 染色體AZFb、c、d區sY127,sY152,sY157,sY254,sY255位點缺失。該患者sY127丟失,代表在AZFb區RBMY1基因有丟失,sY254和sY255丟失,代表在AZFc區的DAZ基因丟失,這些基因缺失,是導致患者不育和精子發生障礙的主要原因[7]。本患者激素水平表現為高LH,而T下降。

總之,本文兩例患者均是嵌合體,且合并Y染色體AZF c、d區位點缺失,推測位于AZFc和AZFd區上基因不僅與精子發生有關,可能還與Y染色體穩定性相關。Y染色體AZF缺失和本身嵌合體核型可能會進一步加劇精子發生衰竭。兩例患者均表現為無精子,建議患者配偶接受供精人工受精。

因此,對于男性不育診斷,除進行常規臨床、實驗室檢查及細胞遺傳學檢查外,還需行Y染色體微缺失檢測,以進一步明確診斷。

[1]傅俊江,李麓蕓,等.精子發生相關基因的分子遺傳學研究進展[J].生殖與避孕,2002,2(6):67.

[2]Krausz C,mc Elreareyk.Y chromosome and male infertility[J].Front Biosci,1999,15(4):E1.

[3]Dada R,Gupta NP,Kucheria K.AZF microdeletions associated with idiopathic and non-idiopathic cases with cryptorchidism and Varicocele[J].Asian J Androl,2002,4(4):259.

[4]劉祥印,薛百功,劉睿智,等.男性不育患者Y染色體AZF區微缺失分析[J].吉林大學學報:醫學版,2008,34(2):305.

[5]Aksglaede L,J?rgensen N,Skakkebaek NE,et al.Low semen volume in 47 adolescents and adults with 47,XXY Klinefelter or 46,XX male syndrome[J].Int J Androl,2009,32(4):376.

[6]Ceylan GG,Ceylan C,Elyas H.Genetic anomalies in patients with severe oligozoospermia and azoosper mia in eastern Turkey:a prospective study[J].Genet Mol Res,2009,8(3):915.

[7]高小燕,楊國鋒,孫 燕,等.AZF微缺失與男性不育[J].生殖與避孕,2006,26(5):302.

Analyses for two patients of chromosomal chimaera and Y chromosomal microdeletions

DAI Ru-lin,WANGRui-xue,ZHANG Zhi-hong,et al.(Center of reproductivemedicine,The First Hospital,JilinUniversity,Norman Bathune Medicine College,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo report two male azoospermic cases of chromosomal chimaera and Y chromosomal microdeletions.MethodsUsing the karyotype analysistechnique to analyze karyotype,PCR assay for Y chromosome microdeletions,serum endocrine hormone to assist.ResultsTwo cases all have chromosomal chimaera.One case karyotype is 46,XX/47,XXdel(Y)(q11),ratio is 19:41.SRY gene exist,but have sY152,sY157,sY254,sY255 microdeletions in the AZFc+d region.The levels of hormone are high follicle-stimulating hormone,high luteinizing hormone,low testosterone.One case karyotype is 46,XY/45,X(Y＜G),ratio is 51:9.SRY gene exist,but have sY127,sY152,sY157,sY254,sY255microdeletions in the AZFb+c+d region.The levels of hormone are high luteinizing hormone,low testosterone.ConclusionThe genes of AZFc and AZFd regions in Y chromosome could have relationships with the stability of Y chromosome.The patients of chromosomal chimaera should detect Y chromosome microdeletions.

azoospermia;chromosomal chimaera;AZF

R698+.2

A

1007-4287(2010)09-1393-04

吉林省科技發展規劃項目(20080444-3)

*通訊作者

戴汝琳(1983-),女,在讀博士研究生,主要從事生殖醫學研究。

2010-01-08)