鋅對糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響

董 宇,劉衛東,孫珉丹,李松鶴

(1.吉林大學第一醫院 眼科,吉林 長春 130021;2.吉林大學第一醫院 腎內科,吉林 長春 130021)

鋅對糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響

董 宇1,劉衛東1,孫珉丹2,李松鶴1

(1.吉林大學第一醫院 眼科,吉林 長春 130021;2.吉林大學第一醫院 腎內科,吉林 長春 130021)

目的研究金屬鋅對大鼠糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響,證實鋅對糖尿病視網膜病變的防治作用。方法用Wistar大鼠建立糖尿病視網膜病變模型,隨機分成4組:正常對照組、正常補鋅組、高糖組、高糖+鋅組。3M后輕摘眼球,在視網膜切片上行VEGF免疫組化。結果正常對照組、正常+鋅組及高糖+鋅組視網膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽性表達,高糖組視網膜石蠟切片VEGF免疫組化明顯陽性表達,高糖組視網膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常組、正常+鋅組及高糖+鋅組相比明顯增高(P＜0.001),正常組視網膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常+鋅組及高糖+鋅組相比無顯著性差異(P＞0.05)。結論我們認為補充金屬鋅能減少糖尿病大鼠視網膜病變VEGF的表達,有防治DR的作用。

糖尿病;視網膜病;金屬鋅;血管內皮細胞生長因子

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1375)

糖尿病性視網膜病變(DR)是一種微血管病變,研究表明DR早期視網膜毛細血管的周細胞和內皮細胞損傷,基底膜增厚,進而引起管腔狹窄和血流改變,促進DR后期發生視網膜缺血、缺氧和新生血管的形成[1]。而血管內皮生長因子VEGF已被公認為DR新生血管生成的重要因子,因此我們通過對糖尿病大鼠補充金屬鋅治療,探討是否能減少視網膜組織VEGF的表達,從而推測金屬鋅對DR的防治作用,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動物模型的建立及分組

體重180-200 g的雄性Wistar大鼠50只,由吉林大學白求恩醫學部基礎醫學院實驗動物中心提供,適應性飼養7 d后用于本實驗。選取其中40只隨機分成4組:正常對照組(8只)、正常+鋅組(8只)、建立糖尿病視網膜病變模型高糖組(12只)、建立糖尿病視網膜病變模型高糖+鋅組(12只);正常+鋅組每日硫酸鋅15 mg/kg灌胃;高糖組腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg體重(新配制的0.1mol/L檸檬酸緩沖液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以誘發糖尿病,正常對照組和正常+鋅組僅注射同樣體積的檸檬酸緩沖液,注射STZ 3d后測尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及飲水明顯增多者列入糖尿病實驗對象,實驗期間大鼠正常飲食水,定期測血糖、尿糖及體重;高糖+鋅組每日硫酸鋅15 mg/kg灌胃并且腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin STZ)40 mg/kg體重(新配制的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液在水浴下配制成2%STZ溶液,PH4.4),以誘發糖尿病,注射STZ 3 d后測尿糖及血糖,以尿糖++++以上,空腹血糖16.5 mmol/L以上;尿量及飲水明顯增多者列入糖尿病實驗對象,實驗期間大鼠正常飲食水,定期測血糖、尿糖及體重,實驗期間大鼠正常飲食水,定期測血糖、尿糖及體重。3 M后各實驗組動物過量麻醉,輕摘眼球后處死大鼠。(除去中間死亡的大鼠及血糖恢復鼠,最后實驗結束時,每組有6只列入統計對象)。

1.2 組織學處理

將眼球固定于10%中性福爾馬林中48 h,經乙醇常規脫水,二甲苯透明后浸臘包埋。連續5 μ m厚切片用于免疫組化。

1.3 免疫組化染色步驟

免疫組織化學染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(S-P法),其操作步驟如下:(1)切片常規脫蠟、脫水。(2)PBS沖洗5 min。(3)3%H2O2-蒸餾水阻斷內源性氧化物酶25 min。(4)PBS沖洗5 min,3次。(5)抗原修復。(6)山羊血清(1∶20)封閉30 min。(7)特異性一抗于切片上,孵育40 min。(8)PBS沖洗5 min,3次。(9)滴加相應的二抗(IgG或Biotin),孵育40 min。(10)PBS沖洗5min,3次。(11)加相應的三抗(S-A/HRP)孵育40 min。(12)PBS沖洗5 min,3次。(13)DAB-蒸餾水溶液顯色。(14)Mayer蘇木精復染,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.4 采用Imagepro-Plus軟件進行數據分析,應用計算機圖像處理技術測定免疫組化視網膜組織累積光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 統計學分析

采用SAS9.0統計軟件進行統計分析。VEGF免疫組化IOD值各組含量采用單因素方差分析。

2 結果

正常對照組、正常+鋅組及高糖+鋅組視網膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽性表達(見圖1、2、3)。

高糖組視網膜石蠟切片VEGF免疫組化明顯陽性表達,在節細胞層尤其在內核層陽性表達(圖4)。

圖1 正常組視網膜石蠟切片VEGF免疫

圖2 正常+鋅組視網膜石蠟切片VEGF免疫

圖3 高糖+鋅組視網膜石蠟切片VEGF免疫

圖4 高糖組視網膜石蠟切片VEGF免疫

高糖組視網膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常組、正常+鋅組及高糖+鋅組相比明顯增高(P＜0.01),正常組視網膜切片VEGF免疫組化IOD值與正常+鋅組及高糖+鋅組相比無顯著性差異,P＞0.05,見表 1。

3 討論

糖尿病性視網膜病變(DR)是糖尿病的主要慢性并發癥之一,它會造成具有特異性改變的眼底病變,以視網膜微血管的病理變化為特征,已經成為雙眼盲的主要原因[2]。

表1 各組視網膜切片VEGF免疫組化IOD值

研究表明糖尿病患者視網膜缺血缺氧,導致血管內皮生長因子(VEGF)代償性增加,促進了視網膜新生血管的形成及纖維增殖[3]。因此目前VEGF被公認為促進新生血管形成的最重要因子,是視網膜增殖性改變的啟動因素[4,5]。另外DR發生導致蛋白質糖基化終末產物(AGEs)和一定的AGEs受體結合,誘導細胞間信號傳導,使視網膜組織產生氧化應激反應及炎癥反應,誘導視網膜VEGF分泌增多[6]。并且大量研究都表明糖尿病性視網膜氧化應激增加,氧自由基增多,氧化產物堆積,組織功能破壞[7,8]是DR發生、發展的重要環節。氧化應激增加的來源包括自由基生成增多或者抗氧化防護組織破壞增加[9]。而金屬鋅是一種抗氧化劑,其廣泛存在于各種眼組織中,參與視黃醇還原酶及視黃醇結合蛋白的形成;鋅還有保護視網膜上皮細胞正常形態的功能,鋅缺乏則出現視網膜色素上皮細胞組織結構和形態的改變,視細胞外段變性。低鋅還可使視網膜抗氧化系統,如SOD的活性降低,造成視覺細胞的過氧化損害[10]。有實驗表明糖尿病患者體內缺乏微量元素鋅,而且糖尿病有視網膜病變者比糖尿病無視網膜病變者更缺鋅。鋅的缺乏成為DR的危險因素[11]。實驗表明鋅對控制糖尿病大鼠高血糖和保護視網膜免遭氧化應激的損害中有積極的效應[12]。

我們在實驗中發現STZ糖尿病大鼠通過補鋅治療后視網膜石蠟切片VEGF免疫組化陽性表達明顯低于STZ糖尿病大鼠組,統計學有顯著性差異(P＜0.001),正常對照組、正常+鋅組視網膜石蠟切片中免疫組化染色VEGF陽性表達,但無顯著性差異(P＞0.05)。這一結果能證實鋅對糖尿病性視網膜病變VEGF過度表達具有抑制作用;并說明生理量補鋅不會影響視網膜VEGF正常表達。因此推測補鋅對糖尿病視網膜病變具有防治作用。

[1]ChibberR,Ben-mahmud BM,Chibber S,et al.Leukocytes in diabetic retinopathy[J].CurrDiabetesRev,2007,3(1):3.

[2]Bunce C,Wormald R Leading causes of certification for blindness and partial sight in England Wales[J].B MC Public Health,2006,6:58.

[3]惠延年.眼科學[M].北京:人民出版社,2005:174-175.

[4]Mathews MK,Merges C,McLeod DS,et al.Vascular endothelial growth factor and vascular permeability changes in human diabetic retinopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1997,D,38(13):2729.

[5]Wirostko B M.Vascular endothelial growth factor[J].Ophthalmology,2007,114(10):1954.

[6]Goh SY,Cooper ME.Clinical review:The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2008,93(4):1143.

[7]Prasad AS,Bao B,Beck FW.Antioxidant effect of zinc in humans[J].Free Radic Biol Med,2004,15,37(8):1182.

[8]Moustafa SA.Zinc might protect oxidative changes in the retina and pancreas at the early stage of diabetic rats[J].Toxiol Appl Pharmacol,2004,201(2):149.

[9]Tate DJ,Newsome DA.A novel zinc compound(zinc monocysteine)enhances the antioxidant capacity of human retinal pigment epithelial cells[J].Curr Eye Res,2006,31(7-8):675.

[10]傅永懷.微量元素與臨床[M].北京:中國醫藥科技出版社,1997:217-218.

[11]聶景蓉,戴桂祥,曾夢蘭,等.微量元素與糖尿病視網膜病變的關系[J].中國醫師進修雜志,2006,29(3):27.

[12]Wang J,Song Y,Elsherif L,et al.Cardiac metallothionein induction plays the major role in the prevention of diabetic cardiomyopathy by zinc supplementation[J].Circulation,2006,113(4):544.

Effect of Zinc on Vascular Endothelial Growth Factor expression in Retinopathy of diabetic rats

DONGYu1,LIU Wei-dong1,SUN Min-dan2,et al.(1.Department ofOphthalmology,First ClinicalHospital of JilinUniversity,Changchun130021,China;2.Department of Nephrology,First Clinical hospital of Jilin University)

ObjectiveTo research preventative and therapeutic effects of zinc on vascular endothelial growth factor(VEGF)in retinopathy of diabetic rat.Methods40Wistar ratwere divided randomly into 4 groups,The normal control group、the normal with zinc group 、the diabetic retinopathy rat model group、the diabetic retinopathy rat model with zinc group.After 3 month,eyeballs were picked,and immunohistochemistry staining for VEGF were done on retinal paraffin slide.ResultsImmunohistochemistry staining for VEGF showed positive expressionin all group,The diabetic retinopathy rat modelgroupishigher thanother groups,whichhave significant difference(P＜0.001).The control group、the normal with zinc group and diabetic retinopathy rat model with zinc group do not have statistical difference(P＞0.05).ConclusionWe think the supplemen of zinc have inhibition effect on VEGF expression,the supplemen of zinc have preventative and therapeutic effects on diabetic retina rat.

Diabetes;Retina;Zinc;VEGF

R587.1

A

1007-4287(2010)09-1375-03

吉林省科技廳應用基礎研究200905137

董宇,碩士研究生導師,主要從事眼底病,眼外傷研究。

2009-11-27)