海洛因及補償AMP和GMP對大鼠海馬組織腺苷脫氨酶的影響

闞慕潔,付海英,洪 敏,劉 暢

(吉林大學白求恩醫學院基礎生物化學教研室,吉林長春 130021)

海洛因及補償AMP和GMP對大鼠海馬組織腺苷脫氨酶的影響

闞慕潔,付海英,洪 敏,劉 暢*

(吉林大學白求恩醫學院基礎生物化學教研室,吉林長春 130021)

目的探討海洛因及補償AMP和GMP對海馬組織嘌呤核苷酸分解代謝關鍵酶ADA的影響。方法劑量遞增腹腔注射海洛因及嘌呤核苷酸,建立了海洛因及補償AMP和GMP的給藥與依賴大鼠模型,用試劑盒檢測海馬組織腺苷脫氨酶(ADA)的活性。提取海馬組織總RNA,采用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測海馬組織ADA mRNA的水平,以βactin mRNA為內標。結果海馬組織中ADA含量測定結果顯示,與鹽水對照組相比,核苷酸組和海洛因組的海馬組織ADA含量明顯升高(P＜0.05,n=10);與海洛因組相比,海洛因加核苷酸組、核苷酸3天組的海馬組織ADA含量明顯降低(P＜0.05,n=10),核苷酸9天組降低更為顯著(P＜0.01,n=10)。海馬組織中ADA mR NA的水平結果顯示,與鹽水對照組相比,海洛因組ADA mRNA的相對表達量明顯增高(P＜0.05,n=3),其余各組與鹽水對照組相比無統計學意義;與海洛因組相比,海洛因加核苷酸組、戒斷3天組、戒斷9天組、核苷酸3天組和核苷酸9天組ADA mR NA的相對表達量明顯降低(P＜0.01,n=3)。結論海洛因通過影響海馬組織ADA的活性,進而促進嘌呤核苷酸的分解代謝,嘌呤核苷酸和/或代謝產物可能通過某些機制影響海洛因對海馬組織的作用,其機制有待進一步研究。

海洛因;大鼠;腺苷脫氨酶;AMP/GMP;海馬

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1372)

海洛因的濫用已成為全球關注的醫學和社會問題。藥物成癮是以強迫性用藥為主要特征的慢性復發性腦疾病。學習記憶已被證實在成癮行為的形成和保持中發揮重要作用[1]。海馬是學習與記憶中樞,可能在成癮中扮演重要角色。阿片類藥物依賴性的形成涉及多重機制,但是迄今為止,確切機制尚未明了。本實驗室首先發現并報告了嗎啡促使大鼠血液中尿酸增高的現象[2]。后來多次實驗反復都證明了這一現象。尿酸在靈長類動物包括人是嘌呤代謝的終末產物,在嚙齒類動物是次終末產物。在探索尿酸增高原因時我們發現,嗎啡給藥大鼠腦、肝臟、小腸、肌肉組織中的ADA含量明顯增高,自然戒斷后開始下降[3]。嗎啡和海洛因能促使腦細胞中嘌呤核苷酸大量分解、合成不足;腦組織中可能存在嘌呤核苷酸“虧欠”的問題,這可能是阿片濫用造成的軀體損害、成癮的原因。本研究建立了海洛因及補償AMP和GMP的給藥與依賴大鼠模型,以海馬組織為主要研究對象,探討海洛因及補償AMP和GMP對海馬組織嘌呤核苷酸分解代謝關鍵酶ADA的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洛因:吉林省公安廳提供,純度98%,用生理鹽水配制后抽濾除菌;單磷酸腺苷(AMP)及單磷酸鳥苷(GMP)(AMRESCO);腺苷脫氨酶檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;722E型可見光分光光度計(上海光譜儀器有限公司制造);恒溫水浴箱;美國TP-200S型電子天平;Trizol核酸提取液(GIBIO公司);AMV反轉錄酶、Rnasin(Promega公司);OligodT、dNTP和TaqDNA聚合酶(鼎國公司);DL2000 marker(寶泰克公司);特異引物由寶生物公司合成,順序如下:ADA擴增產物長度為258 bp。上游引物:5′GCAACATTATCGGCATGGAC 3′下游引物 :5′CAAGATCCACAACCTCATCAG3′;β-肌動蛋白[4]擴增產物長度為 511 bp。上游引物:5′GAAATCGTGCGTGACATTAA3′下游引物 :5′CTAGAAGCATTTGCGGTGC-A3′;PTC-200梯度PCR儀;上海惠普7550型紫外分光光度計;北京六一儀器廠DYY-III4型穩壓穩流電泳儀;紫外透射檢測儀;Kodak凝膠電泳呈像分析系統(EDAS)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型的建立 Wistar大鼠80只,體重150-200 g,本校實驗動物部提供,自由攝食、飲水。隨機分成8組,鹽水對照組(NS),海洛因組(H),核苷酸對照組(A),海洛因加核苷酸組(AH),戒斷3天組(W3),戒斷9天組(W9),核苷酸3天組(A3),核苷酸9天組(A9),每組10只。對照組d1-d10每日兩次腹腔注射(ip)生理鹽水,注射體積及時間與當日海洛因給藥體積及時間相同,d11處死。海洛因組d1-d10每日兩次(AM7:00和PM7:00)ip海洛因,每日次劑量依次為 0.50、0.75、1.25、2.00 、3.00 、4.25 、5.75 、7.50 、7.50 、7.50 mg?kg-1體重,d11處死。核苷酸對照組d1-d10每日兩次(AM7:00和PM7:00)ip核苷酸(AMP與GMP等摩爾混合),每日次劑量均為 7.5 mg?kg-1體重,d11處死。海洛因加核苷酸組d1-d10每日兩次(AM7:00和PM7:00)ip核苷酸和海洛因,核苷酸劑量同核苷酸對照組,海洛因劑量同海洛因組,d11處死。戒斷3天組d1-d10每日兩次ip海洛因(同海洛因組),d11-d13停藥,d14處死。戒斷9天組d1-d10每日兩次ip海洛因(同海洛因組),d11-d19停藥,d20處死。核苷酸3天組d1-d10每日兩次ip海洛因(同海洛因組),d11-d13每日兩次ip核苷酸(給藥同核苷酸對照組),d14處死。核苷酸9天組d1-d10每日兩次ip海洛因(同海洛因組),d11-d19每日兩次ip核苷酸(給藥同核苷酸對照組),d20處死。

1.2.2 海馬組織ADA活性測定 按試劑盒說明書操作。

1.2.3 Trizol法提取海馬組織總RNA 按試劑說明操作。

1.2.4 RT-PCR法檢測海馬組織ADA mRNA

1.2.4.1 RT-PCR法:大約2 μ g RNA 樣品用于 cDNA合成(按試劑說明操作),1 μ lcDNA(大約代表0.1 μ g cDNA)用于PCR擴增。PCR反應混合物組成為:PCR 緩沖液(10 mmol?L-1tris-HCl,pH 8.3;50 mmol?L-1KCl;1.5 mmol?L-1MgCl2;0.001%明膠),0.2 mmol?L-1dNTPs,50 pmol?L-1的 ADA 上游和下游引物,10 pmol?L-1的β-肌動蛋白上游和下游引物,2.5單位的TaqDNA聚合酶,總反應體積為50 μ l。對于ADA的擴增反應條件為95℃3 min 95℃35sec,64℃1 min,72℃1 min,共31個循環。

1.2.4.2 ADA mRNA 鑒定:取 20 μ l PCR 反應產物做1.5%瓊脂糖凝膠電泳,利用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(Electrophoresis Documentation Analysis System,EDAS)對擴增帶進行強度分析,分別計算每條泳道的ADA/β-肌動蛋白總強度比值,用來表示ADA mRNA的水平。

1.2.5 統計學處理 各組數據用SPSS統計分析軟件進行方差齊性檢驗及成組設計資料t檢驗分析。

2 結果

2.1 海馬組織ADA含量的測定

海馬組織中ADA的測定結果見圖1。鹽水對照組到核苷酸9天組,海馬組織ADA的活性分別為2.32±0.52、3.83±1.25、4.78±1.81、2.9±0.91、3.04±1.62、3.16±1.06、2.64±0.42、2.28±0.65(n=10)

圖1 海馬組織腺苷脫氨酸活性

與鹽水對照組相比,核苷酸組和海洛因組的海馬組織ADA含量明顯升高(P＜0.05);與海洛因組相比,海洛因加核苷酸組、核苷酸3天組的海馬組織ADA含量明顯降低(P＜0.05),核苷酸9天組降低更為顯著(P＜0.01)。其余各組未見明顯差異,但戒斷3天和9天組與海洛因組相比有降低的趨勢。

2.2 海馬組織腺苷脫氨酶(ADA)的mRNA的表達

如圖2所示,與鹽水對照組相比,海洛因組ADA mRNA的相對表達量明顯增高(P＜0.05),其余各組與鹽水對照組相比無統計學意義;與海洛因組相比,海洛因加核苷酸組、戒斷3天組、戒斷9天組、核苷酸3天組和核苷酸9天組ADA mRNA的相對表達量明顯降低(P＜0.01)。以β-肌動蛋白511為內參,海馬組織ADA的基因表達水平分別為0.197±0.036、0.27±0.039、0.42±0.037、0.205±0.027、0.108 ±0.036、0.229±0.028、0.199±0.025、0.206±0.014(n=10)。

圖2 海馬組織腺苷脫氧酶的基因表達

3 討論

嗎啡海洛因可以促使大鼠血液中尿酸含量增高[2,7]。在靈長類動物包括人尿酸是嘌呤代謝的終末產物,在嚙齒類動物是次終末產物。在探索尿酸增高原因時我們發現,嗎啡給藥大鼠腦、肝臟、小腸、肌肉組織中的ADA含量明顯增高,自然戒斷后開始下降[3]。同時發現嗎啡可使C6神經膠質瘤細胞中嘌呤核苷酸補救合成的關鍵酶HGPRT和AK的基因表達下調,提示嗎啡可能通過作用于補救合成的關鍵酶而使中樞神經細胞的核苷酸合成代謝出現障礙[5]。在PC12細胞實驗中也獲得類似的結果[6]。在嗎啡依賴動物模型的基礎上,建立了海洛因依賴動物模型,發現海洛因促進大鼠腦組織嘌呤核苷酸的分解代謝,而且可能是通過其分解代謝的關鍵酶腺苷酸脫氨酶(ADA)[7]。腺苷脫氨酶(ADA)是嘌呤核苷酸分解代謝的關鍵酶。ADA催化腺嘌呤核苷轉化為次黃嘌呤核苷,進而分解成次黃嘌呤最終分解為尿酸;海馬組織中ADA的測定結果顯示,海洛因組和核苷酸組的海馬組織ADA含量明顯高于鹽水對照組(P＜0.05);與海洛因組相比,海洛因加核苷酸組、核苷酸3天組的海馬組織ADA含量明顯降低(P＜0.05),核苷酸9天組降低更為顯著(P＜0.01)。可見海洛因可以促進海馬組織ADA的活性,進而促進嘌呤核苷酸的分解代謝,單獨使用核苷酸也可促進海馬組織ADA的活性,而當海洛因給藥的同時補償AMP和GMP時ADA的活性反而降低,停用海洛因后補償核苷酸還能進一步降低ADA的活性,這些結果提示嘌呤核苷酸和/或代謝產物可能通過某些機制影響海洛因對海馬組織的作用,其機制有待進一步研究。RT-PCR實驗結果表明,海洛因給藥均在不同程度上增加了海馬組織ADA mRNA的水平。自然戒斷后,ADA的基因表達很快恢復到對照組水平,但明顯低于海洛因組(P＜0.01);單純使用嘌呤核苷酸對ADA的基因表達無明顯影響;但當海洛因給藥同時補償嘌呤核苷酸,海馬組織ADA的基因表達明顯低于海洛因組;海洛因停藥后補償嘌呤核苷酸ADA的基因表達也明顯低于海洛因組;這結果與蛋白質水平的檢測基本一致,提示了嘌呤核苷酸或其代謝產物可能通過某種途徑對抗海洛因對海馬組織ADA基因表達的影響,進而影響其蛋白質水平上的變化。這種影響是否提示嘌呤核苷酸對海洛因的成癮存在一定程度的治療作用?其相關機制還有待進一步的探索。

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[2]劉劍凱,洪 敏,等.嗎啡依賴大鼠血清尿酸及ALT、AST的檢測分析.醫藥導報,2003,22(4):224.

[3]LIU C,LIU JK,KAN MJ,et al.Morphine enhances purine nucleotide catabolism in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(8):1105.

[4]Negrini M,Monaco C,Vorechovsky I,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in breast carcinomas[J].Cancer Res,1996,56(14):3173.

[5]劉劍凱,洪 敏,趙小冬.嗎啡對C6膠質瘤細胞嘌呤核苷酸代謝相關酶基因表達的影響[J].中華醫學雜志,2003,83(1):46.

[6]孫 婷,何海濤,闞慕潔,等.嘌呤核苷酸減弱嗎啡抑制的PC12細胞嘌呤核苷酸合成代謝[J].吉林大學學報(醫學版),2007,33(6):971.

[7]Yang YD,Zhang JZ,Sun C,et al.Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo[J].Life Sci,2006,78(13):1413.

The effect of heroin and compensating AMP/GMP on adenosine deaminase of hippocampus in rats

KAN Mu-Jie,FU Hai-Ying,HONGMin,et al.(Department of Biochemistry,NormanBethune college of Medicine,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the effect of heroin and compensating AMP/GMP on the adenosine deaminase(ADA)which is the key enzyme of purine nucleotides catabolism of hippocampus in rats.MethodsWe established the heroin and compensating purine nucleotides model of rats.The activities of ADA in the hippocampuswasperformed.RT-PCRwas used to examine the expression level of ADA mR NA.β-actin was used as control gene in RT-PCR study.ResultsCompared with NS group,the activity of ADA in hippocampus of heroin group and purine nucleotides groupwere increased(P＜0.05,n=10);Comparedwith heroin group,the activity of ADA in heroin plus AMP/GMP group,A3 and A9 groupwere greatly decreased(P＜0.05,n=10).The level of transcript of ADA mRNA in hippocampus of heroin group was increased compared with NS group(P＜0.05,n=3);While compared withheroin group,the level of ADA mRNA were decreased in AH,W3,W9,A3 and A9 groups(P＜0.01,n=3).ConclusionHeroin could promote the purine nucleotides catabolism through changing the activity of ADA in hippocampus,Compensate AMP and GMP had some reverse function to heroin,the mechanism need to be explored in the future.

heroin;rat;adenosine deaminase;AMP/GMP;hippocampus

R961

A

1007-4287(2010)09-1372-03

吉林省衛生廳3D5098243426

*通訊作者

2009-02-28)