凝血酶致大鼠腦水腫與腦內MMP-9、MMP-2蛋白表達關系的實驗研究

江漢秋,劉 群,陳 志,張 昱

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經內科,北京 100730;2.吉林大學第一醫院神經內科;3.吉林大學第一醫院泌尿系統疾病診治中心)

凝血酶致大鼠腦水腫與腦內MMP-9、MMP-2蛋白表達關系的實驗研究

江漢秋1,劉 群2,陳 志3,張 昱2

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經內科,北京 100730;2.吉林大學第一醫院神經內科;3.吉林大學第一醫院泌尿系統疾病診治中心)

目的探討凝血酶對大鼠腦內MMP-9、MMP-2蛋白表達的影響。方法Wistar大鼠隨機分為假手術組、對照組及凝血酶實驗組。實驗組腦內注入凝血酶,在不同時間點采用干濕重法測腦水含量,Western blog方法檢測腦內MMP-9、MMP-2蛋白的表達。對照組注入等量生理鹽水。結果腦組織水含量在凝血酶注入后12 h開始增加,3 d達高峰。MMP-9在注射凝血酶后12 h開始明顯表達增加,與對照組相比差異顯著(P＜0.01),3 d達高峰,隨后持續下降。MMP-2在注射凝血酶后24h才開始有明顯表達,后持續增多,5 d達高峰,隨后有所下降,與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。結論凝血酶在腦出血后腦水腫及腦組織損傷中起了關鍵的作用,MMP-9、MMP-2參與了急性期腦水腫過程。

凝血酶;腦水腫;MMP-9;MMP-2;腦出血

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1363)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后腦組織損傷機理一直是國內外研究的熱點,但目前仍不十分清楚。動物實驗已經證實ICH后血塊衍生物、最初的物理性損傷和血腫占位效應是重要原因,而凝血酶(thrombin,TB)是血腫凝血反應過程中釋放的主要物質。本課題組已經研究證實,在大鼠腦內注入凝血酶后,腦組織水含量增加,免疫組化初步明確了其可導致腦內基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和MMP-2表達增多[1]。本文將應用Western blot方法檢測大鼠腦內注入TB后腦組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達的變化,探討凝血酶導致ICH腦水腫的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠140只,鼠齡3-4個月,體重250-300 g,由長春高新技術動物中心提供。將大鼠隨機分成假手術組(20只)、對照組(60只)及凝血酶組(60只)。凝血酶組及對照組分別在術后3 h、12 h、24 h、3 d 、5 d、7 d 處死動物,取腦。每個時間點進行腦組織水含量及MMP-9、MMP-2蛋白表達檢測。各時間點腦組織水含量和蛋白表達檢測各5只大鼠。

1.2 動物模型制備

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(300 mg/kg)。取右側尾殼核為注射部位,在腦立體定位儀下,其坐標為 R3.0 mm、A0.2 mm、H5.5mm,實驗組注入 10 μ凝血酶+50 μ l生理鹽水(凝血酶購自Sigma公司)。用微量進樣器在約5min注血完畢,留針10 min。實驗對照組注入50 μ l生理鹽水,方法同上。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 腦組織水含量檢測 不同組別、不同時間點麻醉大鼠,斷頭處死,迅速取出腦組織,用刀片以針尖為中心取厚度約4 mm右側腦組織,立即稱濕重。將組織放入烘干箱100℃烘烤24 h,再稱干重。按Elliot公式計算腦組織水含量:腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.2 Western blot方法檢測MMP-9、MMP-2的表達

各組取于距血腫灶外側緣2mm左右取腦組織。蛋白定量后,進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,加入含一抗(分別為兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠MMP-2,均購自武漢博士德生物工程有限公司)的反應液,后加入含二抗反應液(羊抗兔IgG)。結果采用國產HP IAS21000型圖像分析儀測定平均光密度值。

1.4 統計學分析 運用SPSS16.0軟件,實驗數據采用(±s)表示。各組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 腦組織水含量

凝血酶組腦組織水含量在3 h較對照組變化不明顯,雖有升高但與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05),12 h已開始有較明顯的變化,24 h-3 d時腦組織水含量變化最明顯,3 d達高峰,與對照組相比差異非常顯著(P＜0.01),7 d時腦組織水含量明顯減少與對照組相比仍差異顯著(P＜0.01)(表1)。

2.2 各組MMP-9蛋白在不同時程的表達

在假手術組MMP-9表達量很少。3 h TB組MMP-9表達增加不明顯,與對照組相比無顯著差異(P＞0.05),同樣在24 h開始明顯增加,3 d達到高峰,后逐漸下降,7 d時仍有較明顯表達。除3 h外各時間點與對照組相比較差異顯著(P＜0.01)(表2)。

2.3 各組MMP-2蛋白在不同時程的表達

在假手術組MMP-2幾乎無明顯表達。腦內注入TB后3 h已可見少量的MMP-2表達,12 h出現了短暫性表達下降,24 h后開始增多,第3 d已可見較為明顯的陽性表達,5 d達到高峰,后開始逐漸下降。TB組各時間點MMP-2表達平均光密度值與對照組相比差異均非常顯著(P＜0.05)(表3)。

表1 各組腦組織水含量的比較(±s)

表1 各組腦組織水含量的比較(±s)

注:與對照組相同時間比較ΔP＜0.01,*P＜0.05。下同。

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術組 63.60±2.80對照組 72.07±2.52 76.31±3.53 79.52±2.92 73.58±1.91 69.37±2.45 67.59±2.82 TB 組 75.02±1.95 83.87±4.00Δ 90.57±2.08Δ 91.66±3.47Δ 86.75±1.09Δ 77.70±2.53Δ

表2 各組病灶周圍腦組織MMP-9平均光密度值(±s)

表2 各組病灶周圍腦組織MMP-9平均光密度值(±s)

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術組 36.09±3.68對照組 40.92±2.95 49.44±3.61 59.41±3.88 78.60±3.40 53.94±2.98 39.15±3.55 TB 組 43.31±3.22 63.04±4.68Δ 104.03±6.00Δ 183.27±7.32Δ 122.06±6.63Δ 77.16±4.94Δ

表3 各組病灶周圍腦組織MMP-2平均光密度值(±s)

表3 各組病灶周圍腦組織MMP-2平均光密度值(±s)

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術組 15.80±2.17對照組 19.70±2.40 18.54±1.88 29.48±3.70 40.63±3.51 45.79±2.72 43.13±2.28 TB 組 27.48±3.46Δ 23.03±2.35* 63.74±4.11Δ 81.34±4.27Δ 103.29±5.56Δ 87.82±4.66Δ

3 討論

目前關于ICH與MMPs關系的研究還比較少,近些年來才有涉及。Power等[2]應用凝膠原酶誘導ICH模型證實,ICH 后MMP-2、3、7、9 mRNA 表達均升高,并參與了ICH后的炎性反應及細胞死亡過程。在隨后,Abilleira等[3]等對ICH患者MMP-9的改變及其是否與腦水腫有關進行了探討。發現ICH患者出現神經癥狀后24h內MMP-9濃度顯著升高。深部ICH患者的MMP-9濃度與出血周圍水腫區的大小、意識障礙的加重顯著相關。這是首次發現人類ICH后血漿內MMP-9濃度升高的研究。隨后Alvarez-Sab í n等[4]對 ICH 患者研究發現,MMP-9的表達增多與腦組織周圍水腫有明顯的相關性。由此可見,MMP-9、MMP-2在ICH后腦組織損傷中占有十分重要的地位,尤其MMP-9在血腫周圍腦組織水腫中具有重要的作用。

TB對ICH后腦水腫的產生具有重要的作用。大量的實驗表明TB在血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞過程中具有重要作用。Lee等[5]在大鼠基底節注射TB,發現TB可誘發明顯的腦水腫,應用TB抑制劑水蛭素等可抑制腦水腫的形成,說明TB在ICH腦水腫形成起重要作用。他們應用同位素標記的α-氨基異丁酸測定BBB通透性發現,認為TB的細胞毒性作用及對BBB通透性的影響是其誘發腦水腫的機制。此外,Sansing等[6]研究表明,血小板計數與腦水腫明顯相關,出血部位激活的血小板釋放因子可以與TB相互作用,增加血管通透性,促進了腦水腫的發展。Hua等[7]在鼠腦分別注入自體全血、全血加水蛭素、袋裝紅細胞、TB、生理鹽水,發現大鼠前肢的狀態與腦水腫呈平行關系。注入TB可引起神經功能缺損,而水蛭素可減輕ICH后的神經功能缺損,袋裝紅細胞可以誘發遲發的腦水腫與遲發的神經功能缺損有關。

本研究已發現在TB注入12 h后開始腦組織病理損傷及腦組織水含量增加,在24 h更為明顯,3 d達到高峰。可見TB在ICH后12 h的腦水腫,尤其是24 h-3 d期間占有絕對優勢。ICH后的24 h-3 d期間正是BBB受損最為嚴重時期,也是腦組織神經元變性壞死、膠質細胞開始增生、炎性細胞浸潤等病理改變最明顯的階段,而此時也是血腫大量釋放TB發揮作用的時間點,故可推測TB釋放造成早期ICH的腦水腫。

本實驗的Western blot結果證實MMP-9表達量在TB組3 h增加不明顯,同樣在24 h開始明顯增加,3 d達到高峰,后明顯下降。TB組3 h也已可見少量的MMP-2表達,12 h出現了短暫性表達下降,24 h后開始增多,5 d達到高峰,后開始逐漸下降。從以上關于腦內注入TB后的MMP-9、MMP-2的研究發現,二者的表達有所不同。①從表達量上看,MMP-9平均灰度值整體高于MMP-2的表達;②從達到高峰的時間上來看,MMP-9只有一個高峰,是在注入TB后3 d,而MMP-2有2個高峰,即注入后3 h及5 d;③從表達的持續時間來看,MMP-2的表達持續時間更長;

Rosenberg等[8]在SHR腦缺血再灌注損傷后3 h即見MMP-2陽性表達的星形膠質細胞。24 h MMP-9開始有表達,免疫組化48 h時可在血管內皮細胞、中性粒細胞、神經元中觀察到MMP-9陽性細胞表達;而在5 d直到21 d后仍可在缺血周圍星形膠質細胞中觀察到MMP-2陽性細胞。Anna[9]等研究發現,MMPs的表達在腦缺血后有2個高峰,即缺血后4 h有MMP-2的短暫性升高,主要在星形膠質細胞表達,MMP-9則在缺血后4 h-4 d主要在神經元及髓鞘纖維束表達,4 d后則為小膠質細胞、巨噬細胞內MMP-2的表達,這與隨后的Magnoni等研究結果基本相同[10]。

通過以上的結果表明,腦內注入TB后MMP-9、MMP-2具有與ICH基本相同的表達趨勢。TB在腦組織的損傷中占有十分重要的地位,ICH后TB的釋放是ICH腦組織改變的非常關鍵的有害物質。TB可能正是通過促使MMP-9、MMP-2的上調而發揮著毒性作用。在組織損傷早期,MMP-9發揮了主要的作用,而MMP-2可能是其在超早期發揮毒性作用的同時更主要的擔當了組織損傷后的修復任務。

[1]江漢秋,劉 群,劉 瑾,等.凝血酶對大鼠腦內MMP-9、MMP-2表達的影響[J].中風與神經疾病雜志,2006,23(1):75.

[2]Power C,Henry S,Del Bigio MR,et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinases[J].Ann Neurol,2003,53(6):731.

[3]Abilleira S,Montaner J,Molina CA,et al.Matrix metalloproteinase-9 concentration after spontaneous intracerebral hemorrhage[J].J Neurosurg,2003,99(1):65.

[4]Mun-Bryce S,Wilkerson A,Pacheco B,et al.Depressed cortical excitability and elevatedmatrix metalloproteinases in remote brain regionsfollowing intracerebral hemorrhage[J].Brain Res,2004,1026(2):227.

[5]Lee KR,Kawai N,Kim S,et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage:effects of thrombin on blood flow,blood-brain barrier permeability,and cell survival in a rat model[J].JNeurosurg,1997,86(2):272.

[6]Sansing LH,Kaznatcheeva EA,Perkins CJ,et al.Edema after intracerebral hemorrhage:correlations with coagulation parameters and treatment[J].J Neurosurg,2003,98(5):985.

[7]Hua Y,Schallert T,Keep RF,et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J].Stroke,2002,33(10):2478.

[8]Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2):104.

[9]Planas AM,Sol é S,Justicia C.Expression and activationof matrix metalloproteinase-2 and-9 in rat brain after transient focal cerebral ischemia[J].Neurobiol Dis,2001,8(5):834.

[10]Magnoni S,Baker A,George SJ,et al.Differential alterations in the expression and activity of matrix metalloproteinases 2 and 9 after transient cerebral ischemia in mice[J].Neurobiol Dis,2004,17(2):188.

Effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin

JIANG Han-qiu,LIU Qun,CHEN Zhi,et al.(Department of Neurology,Beijing Tongren Hospital of Capital Medical University,Beijing100730,China)

ObjectiveTo study effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin.MethodsWistar rats were divided randomly into sham-operated group,control group and experiment group.The animals of experiment group were injected thrombin in brain.At the due time some rats were killed and brain tissue was removed to measure the water content by dry-wet weight method.The others were to measure of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 by Western blot.The animals of control group were injected aequales liquor natrii chloridi isotonicus.ResultsThe water content of brain increased at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days.Comparedwith control group,in experiment group the expression of MMP-9were observed increasing obviously at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days,then decreased gradually.Some of MMP-2 protein were observed until 24 hours in experiment group,and peaked at 5 days,then decreased gradually,and was significantly more than control group(P＜0.01).ConclusionThrombin played a important role in intracerebral hemorrhage on cerebral edema and tissue impairment.MMP-9 andMMP-2 contributed to brain edema in the acute phase of ICH.

Thrombin;cerebral edema;MMP-9;MMP-2;ICH

R743.34

A

1007-4287(2010)09-1363-03

2010-03-14)