DC聯合CIK細胞對中晚期消化系統腫瘤患者的免疫功能的影響

劉林林,劉 念,楊艷明,顧 華,王 欣

(吉林大學第二醫院 腫瘤生物治療科,吉林 長春 130041）

過繼免疫治療(Adoptive Cellular Immunotherapy）是通過能直接或間接介導抗腫瘤效應的免疫細胞輸注腫瘤患者體內的一種腫瘤治療方法,目前已成為腫瘤治療的一個全新的領域。其中細胞因子誘導的殺傷(cytokine-induced killer,CIK）細胞是繼淋巴因子激活的殺傷(lymphokine activated killer,LAK）細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltration lymphocyte,TIL）后的新型細胞,其增殖能力和殺傷活性顯著高于LAK細胞,是一種安全的輔助治療手段[1]。但臨床觀察中發現部分患者在接受CIK免疫治療后,療效不理想,認為是腫瘤細胞對這些免疫效應細胞發生了抵抗,這可能與腫瘤患者功能性的DC缺乏有關。DC作為體內功能強大的專職抗原遞呈細胞 ,在細胞毒性T細胞的活化過程中發揮著重要的作用。CIK細胞和DC聯合應用,不僅可增強免疫效應細胞的抗腫瘤活性,還可以使效應細胞對腫瘤靶細胞的殺傷更具特異性,是目前腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。

消化系統腫瘤病程發展快,患者就診時往往已屬中晚期,失去了手術治療的機會。為了探討細胞免疫療法對中晚期消化系統腫瘤的治療效果,本研究選擇27例中晚期消化系統腫瘤患者(男21,女6,中位年齡60歲）,觀察DC聯合CIK細胞治療對患者免疫功能的提升作用并評估近期療效,為其在臨床中晚期消化系統腫瘤治療中的廣泛應用提供臨床資料和證據。

1 資料與方法

1.1 患者的入選標準本組27例均經影像學、細胞學及理學等檢查確診為消化系統惡性腫瘤 ,并根據國際抗癌聯盟(UICC）分期標準進行臨床分期,所有患者卡式評分達60分以上,預計生存期大于6個月,無嚴重的心臟、腎臟及肝臟功能損害(患者一般資料見表1）。

表1 入選患者一般資料

1.2 DC細胞的制備所有操作均嚴格遵守標準操作規程(SOP）的程序。應用外周血單個核細胞采集患者外周血2-3X109個單個核細胞 及血漿80 ml(Kabi Fresenius,German）。經 Ficoll-Hypaque(Gibco,USA）分離單個核細胞后,離心洗滌兩次,用無血清RPM1640(PAA laboratories GmbH,Linz,Austria）重懸,調整細胞濃度為2-4×106/ml鋪入6孔板,置于37℃、5%CO2培養箱中,孵育兩小時后,輕晃 6孔板,收集懸浮細胞至另一個50 ml離心管,用無血清AIM V(invitrogene）培養液洗板1-2次,加入無血清AIM V(invitrogene）培養液繼續培養;第三天補加DC培養液2-3 ml/孔;第五天加入腫瘤特異性抗原(終濃度為 20-80 μ g/ml）,誘導后 12-16 小時,加入TNF-1(500 U/ml）;第8天收集細胞,離心,生理鹽水洗滌3次,用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸,總體積為100 ml,經靜脈回輸患者,共四次,每次回輸間隔4天。

1.3 CIK細胞制備將經Ficoll-Hypaque(Gibco,USA）分離的單個核細胞重懸于無血清AIM V(invitrogene）培養液中,以 2×106/ml鋪入培養瓶,補加INF-(1 000 U/ml）,置于 37℃、5%CO2培養箱中孵育 ;次日補加 CD3單抗(0.5 μ g/ml）及 IL2(1 000 U/ml）,繼續培養;第3天用無血清AIM V(invitrogene）培養液進行補液;第11-12天收集CIK細胞,離心,生理鹽水洗滌3次,用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸,總體積為100 ml,經靜脈回輸患者,共四次,回輸時間選擇在兩次DC回輸之間。

1.4 細胞的質量控制及活性分析

1.4.1 無菌檢測 在每次細胞回輸前兩天將培養液涂板進行細菌學培養,在每次細胞回輸前1小時通過凝膠法進行細菌內毒素檢查。

1.4.2 細胞的免疫活性分析 分別在第7天及第12天收集DC及CIK細胞,數量為2×106,分別用CD3、HLA-DR、CDlα、CD80、CD86 標記 DC 細胞,用 CD3/CD56標記CIK細胞,在4℃避光標記30 min,洗滌兩次,重懸于 500 μ lPBS 中,上機檢測(Calibor BD）。

1.5 回輸前后患者免疫功能分析分別于單個核細胞采集當天及治療結束后第7天采集患者外周血,分別用 CD3、CD4、CD8、CD56 進行熒光標記 ,進行T細胞亞群的檢測。

1.6 毒副反應觀察每次免疫細胞回輸后觀察患者是否出現發熱、皮疹等毒副反應。

1.7 患者近期療效的評估

1.7.1 患者治療前后生活質量改善 應用EORTC QLQ-C30生命質量測定表及卡氏評分標準評價患者生活質量改善情況。

1.7.2 按WHO關于腫瘤近期療效評價的標準,在患者治療前及治療后1個月行CT及超聲進行對照比較,療效分為完全緩解(CR）,部分緩解(PR）,輕度緩解(MR）,穩定(SD）,進展(PD）,治療有效率=CR+PR,腫瘤緩解率=CR+PR+MR。

1.8 統計學處理采用SPSS 10.0統計軟件分析。率的比較均采用 χ2檢驗,計量資料采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CIK細胞體外擴增及細胞表型分析結果經體外擴增后CD3+細胞陽性率由64%提高到95%,CD3+/CD56+細胞由3%提高到28.7%,有統計學差異(P＜0.05,見圖1）。

2.2 治療前后患者免疫功能分析患者治療前免疫功能低下,表現為T輔助細胞(CD3+/CD4+）百分率低于正常,而T抑制細胞(CD3+/CD8+）高于正常,造成二者比值降低。治療后患者T輔助細胞陽性率顯著升高,T抑制細胞陽性率降低,二者比值回復正常。同時患者體內NKT細胞(CD3+/CD56+）也明顯升高。結果有統計學差異(P＜0.05）(見表2及圖2）。

圖1 體外培養10天后CIK細胞表性分析

表2 患者治療前后免疫細胞表性分析

圖2 患者治療前后免疫細胞表型對比分析

2.3 毒副反應觀察患者經DC聯合CIK細胞治療后,27例患者中有5例患者出現一過性發熱反應(溫度≤38.5℃）,未經過特殊處置在24 h內即降至正常。

2.4 患者生活質量改善

2.4.1 EORTC QLQ-C30生命質量測定表測定結果

表2 CIK細胞治療后癥狀緩解情況

2.4.2 27例用Karnofsky評分來評估生存質量的改善。治療后卡式評分平均提高10-20分,其中提高19例,穩定6例 ,下降2例,提高率為70.4%。

2.5 瘤體變化22例患者經DC聯合CIK細胞治療后 PR 5例,MR9例,SD 8例,PD 5例,有效率(CR+PR）為51.8%(14/27）,腫瘤控制率(CR+PR+SD）為 81.4%(22/27）。

3 討論

CIK(cytokine induced killer）細胞是外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞。Schmidt-Wolf[2]等首次報道了在多種細胞因子作用下,外周血淋巴細胞可以被定向誘導成具有殺傷腫瘤活性的免疫效應細胞,由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子,因此具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性自然殺傷細胞(NK）的非主要組織相容性復合體(MHC）限制性殺瘤的優點。體外及動物研究證實CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對正常骨髓造血前體細胞毒性小等多種優勢[3-4]。目前CIK細胞已應用于部分臨床惡性腫瘤的治療,取得了較好的效果。Kim[5]等將自體CIK細胞回輸原發性肝細胞癌患者體內后,提高了機體的免疫應答水平,改善了肝臟功能,患者的癥狀減輕,無不良反應。Jiang[6-7]等研究顯示,CIK細胞聯合化療治療IV期胃癌的患者,能明顯提高患者的生存質量,延長晚期胃癌患者的2年生存期,同時不良反應較小。但在應用CIK等免疫效應細胞進行過繼免疫治療時,部分患者的治療效果不太理想,這可能與腫瘤患者功能性DC細胞缺乏有關。DC作為體內功能最強大的抗原遞呈細胞,能誘導出抗原特異性細胞毒T淋巴細胞反應(Cytotoxic T lymphocyte,CTL）,在人抗腫瘤免疫的治療中發揮了重要的作用[8-9]。將CIK細胞和DC細胞聯合起來治療惡性腫瘤,將有助于解除部分腫瘤患者T細胞的免疫無能,從而最大程度發揮其協同抗腫瘤作用。

CIK細胞強細胞毒活性源于其較高的存活率和較強的增殖能力,在本研究中,27例患者的單個核細胞經體外培養后10天,CD3+細胞數平均增加了35倍;CD3+/CD56+細胞百分率從3%提高到28.75%,細胞平均擴增了320倍。說明本研究所采用的體外擴增技術能夠滿足對CIK細胞的高效擴增,從而發揮強大的抗腫瘤作用。惡性腫瘤患者存在T細胞亞群狀態異常和比例失調[10]。在免疫治療前,27例患者中90%以上的患者體內存在免疫功能低下,表現為T輔助細胞(CD3+CD4+）減低或T抑制細胞(CD3+CD8+）百分率升高,CD4/CD8比值下降,其中肝癌患者免疫功能下降最為明顯。在應用DC聯合CIK細胞進行過繼免疫治療后7天,CD3、CD3+/CD4+陽性細胞顯著升高,CD3+/CD8+下降,差異有顯著性(P＜0.05）,說明細胞免疫治療能夠明顯增強機體的細胞免疫功能,提高機體的抗腫瘤免疫效應。治療中出現不良反應僅為發熱,發生率為0.18%,與文獻報道相似[11]。27例患者中約70%以上的患者在治療后出現體力增加、食欲增強、、睡眠恢復等生活質量改善征象。70.4%患者卡式評分增加10-20分,癥狀的改善與患者免疫功能的提高有關。在臨床療效方面,治療腫瘤的總有效率為51.8%,腫瘤控制率為81.4%。研究中發現不同類型的腫瘤療效并不相同,結直腸癌及胰腺癌的有效率高于肝癌,考慮與肝癌患者存在原發病毒感染導致免疫功能明顯降低有關。

在本研究中,我們揭示了DC聯合CIK細胞免疫治療能夠提高中晚期消化系統腫瘤患者的免疫功能進而發揮強大抗腫瘤免疫效應,是一種安全、有效的抗腫瘤治療手段。

[1]Schmidt-wolf IG,Lefterova P,Johnston V,et a1.Propagation of largenumbers of T cells with natural killer cell markers[J].Br J Hacmatol,1994,87(3）:453.

[2]Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1）:139.

[3]Hongcng S,Petvises S,Worapengpaiboon S,et al.Generation of CD3+CD56+cytokine-induced kiler cells and their in vitro cytotoxicity against pediatric cancer cells[J].Int J Hematol,2003,77(2）:175.

[4]Karlens S,Gilljam M,Chambers BJ,et al.A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3+CD56+natural killer cells[J].Hum lmmunol,2001,62(10）:1092.

[5]Kim HM,Lim J,Yoon YD,et al.Anti-tumor activity of ex vivo expanded cytokine-induced killer cells against human hepatocellular carcinoma[J].Int Immunopharmacol,2007,7(13）:1793.

[6]Jiang J,Xu N,WuC,et al.Treatment of advanced gastric cancer by chemotherapy combined with autologous cytokine-induced killer cells[J].Anticancer Res,2006,26(3B）:2237.

[7]Jingling Jiang,Changping Wu,Liangrong Shi.Side effects during treatment of advanced gastric carcinoma by chemotherapy combined with CIK-cell transfusion in elderly people[J].Chinese Journal of Clinical Oncology,2008,5(2）:79.

[8]Banchereau J,Steinman RM.Dentric cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392(6673）:245.

[9]Reid SD,Penna G,Adorini L,et a1.The control of T cell responses by dentritic cell subsets[J].Curt Opin Immunol,2000,12:114.

[10]Robinson E,Segal R,Struminger L,et al.Lymphocyte subpopulations inpatients with multiple primary tumor[J].Cancer,1999,85:2073.

[11]Paola Olioso,Raffaella Giancola,Maria Di Riti,et al.Immunotherapy with cytokine induced killer cells in solid and hematopoietic tumours:a pilot clinical trial[J].Hematol Oncol,2009,27:130.