pH值對產氫細菌 Ethanoligenens harbinense YUAN-3的影響

謝天卉,趙 鑫,路 璐,吳 迪,付 娜

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室,哈爾濱 150090)

氫氣以其清潔、高效、可再生等特點,成為人們理想的能源載體之一.產生氫氣的方法有很多種,其中發酵法生物制氫技術以其環境友好、不消耗化石燃料、產生清潔能源等特點,日漸得到人們的關注[1-3].但產氫效率不高始終制約著發酵法生物制氫技術的規模化進程.分離篩選高效產氫細菌,并為優化生態因子是解決該問題的方法之一[4-5].

Ethanoligenens harbinenseYUAN-3(哈爾濱產乙醇桿菌)[6-8]是從乙醇型發酵生物制氫反應器中分離得到一株產氫細菌,其主要液相代謝產物為乙醇和乙酸.該細菌不僅具有較高的產氫效能,而且具有自凝集的特性,易形成菌粒而沉降在反應器中,避免菌種流失,適合工程應用.

初始 pH值是影響產氫細菌生長和產氣的重要生態因子之一,大多數產氫細菌的最適 pH值都集中在中性,pH值過高或過低都會制約產氫細菌的發酵過程,影響細菌代謝.Enterobacter HO-39的產氫最適 pH值范圍是 6.0～7.0,并可以在 pH值為 3.3的酸性環境產氣[9];Citrobacter Y19的最適產氫 pH范圍也是 6.0～7.0,但是在 pH值為 4.0時,喪失產氫能力[10].因此,探討 pH值對產氫細菌 E.harbinenseYUAN-3的產氫和生長的影響對揭示其生理生態學特性具有重要的意義.本文利用E.harbinenseYUAN-3作為研究對象,研究了不同初始 pH值對其生長、產氫等方面的影響,以期能夠為菌株 YUAN-3在實際工程中的應用提供指導.

1 材料與方法

1.1 菌株

產氫細菌 Ethanoligenens harbinense YUAN-3[6-8],分離自活性污泥,由本實驗室保存.

1.2 間歇產氫實驗

將處于對數生長期的菌體以 10%(V/V)的比例接種到不同磷酸鹽質量濃度的培養基中,在間歇實驗裝置上進行厭氧發酵產氫實驗,35℃條件下,130 r/min振蕩培養,排水法測定氣體體積.培養基組分如下:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 4 g/L,酵母粉 1 g/L,NaCl 4 g/L,MgCl2·6H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,L-半胱氨酸 0.8 g/L.通過磷酸氫二鈉和檸檬酸的不同配比使培養基的初始 pH值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0,考察初始 pH值對于 YUAN-3生長、產氣等情況的影響,每組 5個平行樣.

1.3 發酵產物的分析

液相產物測定使用 Agilent 4890型氣相色譜儀,30m×0.53 mm HP-FFAP熔融石英毛細管柱,氫火焰檢測器,氮氣作載氣,流速 60m L/min,氫氣流速 60mL/min,進樣口、爐溫、檢測器溫度分別為 220、180、300 ℃.樣品在 5 000 r/min下離心15 min,取上清液 1 m L,加入一滴 6 mol/L HCl溶液,取 1μL進樣.

氣相產物測定使用另外一臺 Agilent 4890型氣相色譜儀,其中 15 m×0.530 mm毛細管柱(19095P-QO3,Agilent),熱導檢測器,氮氣作載氣,進樣量 500μL.

生物量主要用細胞干重來衡量.發酵結束后,將發酵液在 5 000 r/min下離心收集菌體,經生理鹽水重懸、洗滌 2次后 80℃下烘干至恒重,稱重葡萄糖的測定采用上海榮盛生物技術有限公司生產的葡萄糖(Glu)測定試劑盒——GOD-PAP法pH值采用 pH-S25型酸度計進行測量.

2 試驗結果與討論

2.1 pH值對 YUAN-3生長的影響

YUAN-3在試驗的各個 pH值都表現出一定的生長能力,見圖1.在 pH值 4.0時,YUAN-3的細胞干重最小,為 0.34 g/L-培養基.隨著 pH值的不斷增加,細菌的生物量也逐漸增加.在 pH值7.0時,細胞干重達到最大,為 0.59 g/L-培養基,此后細菌生物量略有下降.可見 YUAN-3在中性和弱酸的 pH值范圍內,都可以很好的生長,并保持較高的生物量.

通常情況下,乙醇型生物制氫反應器的 pH值維持在 4.5～5.0左右,而將 YUAN-3投加到生物制氫反應器中是一種很好的生物強化的手段.盡管在初始pH值 4.5～5.0的范圍內并不是 YUAN-3生長最旺盛的階段,但 YUAN-3在弱酸的情況下,依然能夠保持較高的生物量,說明 YUAN-3具有較高的應用價值.

圖1 初始 pH值對 YUAN-3生長的影響

2.2 pH值對 YUAN-3產氣能力的影響

隨著初始 pH值的提高,生物氣、氫氣以及氫氣的含量(V/V)都呈現出先升高再降低的趨勢(圖2).在 pH值為 6.0時,生物氣和氫氣均達到最大,分別為 1 886 m L/L-culture和 997 mL/L-cul ture,此時的氫氣體積含量也達到最大為 52.8%在 pH值從 4.0到 8.0的范圍內,YUAN-3均能產氣,且在 pH值大于 4.5開始,YUAN-3的產生氫氣的體積百分含量始終大于 40%,說明 YUAN-3是一株具有較強耐酸能力的產氫細菌,能夠在弱酸性環境中維持較高的產氫能力.

圖2 初始pH值對YUAN-3產氣能力的影響

隨著初始 pH值的不斷增加,YUAN-3的平均產氫速率和比產氫率也先升高再逐漸降低(圖3).在 pH值為 6.0時,平均產氫速率達到最大,為5.75mmolH2/g-CDW·h,隨后呈逐漸降低的趨勢.這說明,在 pH值為 6.0時,產氫細菌具有較高的細胞產氫活性,pH值過低會抑制細菌的生長和產氫;pH值高于 6.0時細菌的產氫量略有下降,細胞活性有所降低.同樣 YUAN-3的比產氫率也在pH值為 6.0時達到最大,為 2.32 molH2/mol-葡萄糖.這說明此時的細菌還具有良好的葡萄糖轉化率.

圖3 初始 pH值對 YUAN-3平均產氫速率和比產氫率的影響

2.3 pH值對 YUAN-3液相末端產物的影響

發酵液相末端產物主要是乙醇和乙酸,二者的量都隨 pH值升高而呈先增加再降低的趨勢(圖4),這種現象與細菌的產氫的情況是一致的.液相末端產物的增加主要是由于中性范圍更有利于YUAN-3的發酵造成的.本次發酵利用的是緩沖溶液,故緩沖溶液的緩沖能力在發酵結束的 pH值得以體現,隨著初始 pH值的增加,發酵結束時的pH值略有升高.在初始 pH值為 4.0時,發酵終止時 pH值為 3.78,而初始 pH值為 8.0時,發酵終止時的 pH值為 4.65.初始 pH值在 6.0～7.0時,發酵終止的 pH值有所下降,是因為在這個初始pH值范圍,發酵進行的相對徹底,產生了大量的乙酸,導致此時 pH值有小幅的下降.而后來終止時的 pH值又逐漸升高,一方面是因為初始 pH值較高,另一方面是因為發酵過程相對于 pH值 6.0～7.0來說,進行不夠徹底.平時未使用緩沖溶液時,發酵終止時 pH值常常低于 3.5,可見緩沖溶液在發酵過程中發揮了一定作用,在一定程度上減緩了pH值下降的速度,但是由于乙酸的大量產生,緩沖溶液并不能改變 pH值下降的趨勢.

圖4 初始pH值對 YUAN-3代謝產物的影響

此外 YUAN-3具有自凝集的能力,能夠通過細菌的互相包裹形成菌粒而沉降在培養基底部,培養基自始至終都是清澈的.在不同的 pH值,YUAN-3形成的菌粒大小不同,用肉眼觀察在 pH值從5.0～8.0的范圍內,YUAN-3形成的菌粒平均直徑可以達到 4～5 mm,而 pH值小于 5.0,形成的菌粒直徑明顯變小,只有 2mm左右,可見 pH值也在一定程度上影響 YUAN-3的凝集能力.

3 結 語

通過間歇試驗考察不同 pH值對于產氫細菌YUAN-3生長和產氣的影響,可以發現在初始 pH值為 7.0時,細胞干重達到最大,為 0.59 g/L-培養基.在含有緩沖體系的培養基初始 pH值為 6.0時,平均產氫速率和比產氫率都達到最大,分別為5.75 mmolH2/g-CDW· h和 2.32molH2/mol-葡萄糖.因此,可以將 YUAN-3的初始培養基 pH值范圍控制在 6.0～7.0,可以獲得更多產氫活性較高的產氫細菌.YUAN-3可以在弱酸性環境中生長和產氣,是一株具有工程應用價值的產氫細菌.

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