ELISA技術(shù)在犬病毒與抗體檢測中的應(yīng)用

修福曉 （公安部警犬技術(shù)學(xué)校 沈陽 110034）

ELISA技術(shù)在犬病毒與抗體檢測中的應(yīng)用

修福曉 （公安部警犬技術(shù)學(xué)校 沈陽 110034）

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附測定，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性、特異性較高的試驗技術(shù)。比較常用的ELISA方法有雙抗體夾心法和間接法。ELISA主要用在人、豬、禽等傳染病的病原及抗體檢測。由于犬常見的傳染病主要是病毒性疾病，現(xiàn)將ELISA在犬主要病毒病的病原診斷和抗體檢測方面的應(yīng)用做一介紹。

1 ELISA在犬病毒病病原診斷方面的應(yīng)用

目前犬常見的病毒性傳染病主要有犬細(xì)小病毒病﹑犬瘟熱﹑犬傳染性肝炎。這也是對犬危害比較大的三種傳染病。這三種傳染病的病原診斷方法主要有PCR、免疫膠體金技術(shù)、電鏡、免疫熒光法、ELISA、血凝實驗。其中PCR、免疫膠體金技術(shù)、電鏡、免疫熒光法檢測靈敏度高，但是這些方法需要先進(jìn)的儀器設(shè)備并且檢測成本高，不易推廣使用。血凝實驗雖然容易操作且成本低，但是其靈敏度低。相比于上述檢測方法，ELISA技術(shù)有著靈敏度較高、診斷快速、容易推廣等優(yōu)點。結(jié)合國內(nèi)外ELISA診斷犬病毒病的研究現(xiàn)狀，現(xiàn)對ELISA在上述三種疾病病原診斷分別進(jìn)行闡述。

犬細(xì)小病毒病是具有高度接觸性的烈性傳染病，嚴(yán)重威脅著寵物的身體健康。ELISA檢測方法方便快捷、費用低廉，特且適于在基層推廣。因此國內(nèi)外對ELISA用于檢測犬細(xì)小病毒病病原的研究比較多。鄭學(xué)引[1]等建立了雙抗體夾心ELISA，在室溫(20℃)或37℃下進(jìn)行試驗，1h就可以測出0.8ng的CPV。Drane[2]建立的檢測CPV的ELISA方法，與病毒分離方法相比，該ELISA法的靈敏度和特異性分別為87%和100%。此外，還有學(xué)者運用ELISA技術(shù)開發(fā)了檢測CPV的試劑盒，田克恭[3]等用CPV單克隆酶標(biāo)抗體制成CPV快速診斷盒，可在2h內(nèi)檢出糞便中的CPV抗原。劉宏偉[4]等采用了夾心ELISA原理，研制成功了犬細(xì)小病毒快速診斷試劑盒，對從臨床病例中收集獲得的47份糞便樣品分別用血凝試驗和試劑盒進(jìn)行檢測，兩種方法的符合率為91.5%，對于明顯陽性和陰性樣品，兩種方法符合率為100%。該試劑盒具有簡便、快速及特異的優(yōu)點，在30min即可肉眼判定結(jié)果。

目前ELISA直接用來檢測犬瘟熱病毒的研究相對較少。由于犬瘟熱病毒只有N蛋白中間區(qū)在不同CDV毒株中的氨基酸序列同源性可達(dá)99%以上，可以利用此蛋白的保守特點，制備單克隆抗體，可使用雙抗體夾心法或Dot-ELISA法來檢測犬瘟熱病毒。金鑫[5]等采用的Dot-ELISA 方法來檢測犬瘟熱病毒，隨機抽取的22份樣本經(jīng)電鏡觀察與Dot-ELISA檢測結(jié)果比較，兩者符合率94.74%，證明所建立的Dot-ELISA檢測方法特異性較高。

犬傳染性肝炎發(fā)病范圍包括警犬、家養(yǎng)寵物犬、實驗犬等，一旦感染會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對犬傳染性肝炎病毒(CAV-1)的研究主要集中于對CAV-1的快速檢測、診斷、治療藥物和疫苗。CAV-1與犬傳染性喉氣管炎病毒(CAV-2) 具有共同的抗原決定簇，因此在診斷上的重點和難點在于如何將二者區(qū)分開，避免造成誤診。這就需要找到CAV-1保守性高且CAV-2不存在同源性的蛋白來制備單克隆抗體，才能將二者區(qū)分開。許偉成[6]等制備了CAV-1型特異性單抗，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Dot-ELISA檢測犬傳染性肝炎病毒，本法只與CAV-1起反應(yīng)，與CAV-2、CPV、CDV不起反應(yīng)，具有較高的診斷特異性。

2 ELISA在檢測犬病毒病抗體方面的應(yīng)用

目前，ELISA在檢測方面的研究主要集中在狂犬病病毒抗體、犬細(xì)小病毒抗體、犬瘟熱病毒抗體。

對犬進(jìn)行狂犬病病毒抗體的檢測可以了解狂犬病隱性感染情況，進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測。另外，通過測定疑似患病早期和晚期雙份血清中和抗體水平的差異(如抗體水平增高4倍以上)，作為狂犬病確診的依據(jù)之一。Karamany[7]等，Grassi[8]等報道過他們各自建立的用抗人二抗檢測人抗狂犬病抗體的間接ELISA方法。國內(nèi)李金中[9]等人報道了用夾心阻斷ELIsA測定血中抗狂犬病抗體的研究。但是目前所建立的所有ELISA檢測狂犬病抗體的方法無法替代OIE推薦的方法用于基層篩查。

劉劍郁[10]等建立了間接ELISA檢測犬細(xì)小病毒病血清抗體的方法。謝聯(lián)香等以CPV全病毒純化后作為包被抗原建立了間接ELISA方法，獲得了良好的效果。該抗原不與CDV、ICHV、CCV和FPV病原陽性血清反應(yīng)，具有良好的特異性。同時經(jīng)過研究已證實該方法具有良好的重復(fù)性。用所建立的間接ELISA和HI試驗對20份免疫犬血清進(jìn)行檢測，符合率為80%，可見具有良好的敏感性。犬細(xì)小病毒的VP2基因具有很強的免疫原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。因此，李慕瑤[11]等利用大細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)蛋白，建立了間接ELIsA方法，并且與血凝抑制試驗相比較應(yīng)用于臨床樣品的檢測，兩者的陽性符合率為89.1%，ELISA方法檢測的陽性率為83.3%，血凝抑制試驗的陽性率為74.2%。說明建立的ELISA方法比血凝抑制試驗具有更高的敏感性。

CDV的N蛋白保守中間區(qū)在不同CDV毒株中的氨基酸序列同源性可達(dá)99%以上，將其作為抗原，可檢測出CDV不同毒株感染產(chǎn)生的抗體。因此，N蛋白可作為CDV抗體的檢測抗原。Veronica[12]等建立了一種新的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測方法，采用了重組桿狀病毒表達(dá)CDV野生型分離株2544/Han95的N蛋白，目的是在犬科動物血清中檢測CDV特異性抗體。重組桿狀病毒表達(dá)的抗原通過Heliothis Virescens菌株來高效表達(dá)生產(chǎn)，這種新型ELISA能夠明確定性地檢測CDV的IgG和IgM，表現(xiàn)出了較高的敏感度和較強的特異性，并且相對于傳統(tǒng)的CDV檢測法，其代表了一類快速和檢測費用適中的新方法。

3 總結(jié)

對于大規(guī)模的犬飼養(yǎng)基地，必須做好免疫預(yù)防工作，雖然目前的商品化疫苗都有推薦的免疫程序，但是不同的地區(qū)存在著疾病流行的差異，應(yīng)制定適合本地區(qū)的合理科學(xué)的免疫計劃。采用ELISA技術(shù)來檢測疫苗免疫后的抗體水平變化情況，以此來來評測所制定的免疫計劃是否能夠?qū)θa(chǎn)生免疫保護(hù)作用，從而制定適合本地區(qū)的科學(xué)免疫計劃。用ELISA對犬飼養(yǎng)場定期進(jìn)行抗體的監(jiān)測，可以提高疫苗的免疫保護(hù)率，防止傳染病的傳播擴展。

目前，大多數(shù)的動物病毒感染性疾病缺乏有效的治療藥物，所以準(zhǔn)確快速的診斷已成為控制病毒性傳染性疾病流行和蔓延的一個重要手段。ELISA方法是一種敏感、特異、快速的診斷方法，使用方便，已在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查上得到了廣泛的應(yīng)用，適用于大批量樣本的檢測，是比較理想的檢測方法之一。因此ELISA用于犬病毒及抗體檢測的研究已越來越多，技術(shù)也更加成熟，并開發(fā)了相關(guān)檢測試劑盒。但是與間接免疫熒光法、PCR等方法比較，ELISA的敏感性和特異性較低，如何提高ELISA的敏感度和特異性，是今后研究工作的一個主要方面。已有學(xué)者將ELISA方法與其它方法聯(lián)合應(yīng)用，如酶免疫斑點法、ELISA結(jié)合微粒子酶免疫測定法，這些改進(jìn)的方法能極大提高檢測的靈敏度，同時又能被較好的推廣應(yīng)用。

[1]鄭學(xué)引, 謝二星. 犬細(xì)小病毒性腸炎實驗室診斷技術(shù)簡介[J].上海實驗動物科學(xué), 1995, (1): 50-52.

[2]Drane DP, Hamilton RC, Cox JC, et al. Evaluation of a novel Diagnostic test for canine Parvovirs. Veterinary Microbiology, 1994, 41: 293-302.

[3]田克恭. epv單克隆抗體研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 1999, 25(2): 54-56.

[4]劉宏偉, 田克恭, 梁川玫等. 犬細(xì)小病毒酶標(biāo)試劑盒的研制[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 1994, (6): 10-13.

[5]金鑫, 魯承, 呂相哲等. Dot-ELISA檢測犬瘟熱病毒抗原的研究[J].中國獸醫(yī)科技, 2000, 30(6): 21-22.

[6]許偉成, 馬志勇, 蔡寶祥等. 犬傳染性肝炎病毒單克隆抗體研究[J].中國畜禽傳染病, 1992, (3): 33-34.

[7]Karamany RM，Kazar J，Malik SA，et al.Rapid quantitative assay of rabies Post-vaceination antibody by ELISA.APMIS Suppl，1988，3:40-3.

[8]GrassiM, Wa ndelerAl，Peterhans E.Enzyme-linked immnunosorbent assay for determination of antibodies to the envelope glycoprotein of rabies virus.J Clin Microbiol, 1989, 27(5):899-902.

[9]李金中, 夏平安, 李佑民等.應(yīng)用夾心阻斷ELISA測定血清中抗狂犬病抗體的研究.獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 1992, 12(4):341-344.

[10]劉劍郁, 李曉成, 陳德坤等. 間接ELISA檢測犬細(xì)小病毒病血清抗體方法的建立[J]. 中國動物檢疫, 2006, 3(23): 7-9.

[11]李慕瑤, 姜賽, 劉家森等. 犬細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)及間接ELlSA方法的建立. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(3): 218-222.

[12]Veronika von Messling,Roberto Cattaneo.Amino-Terminal Precursor Sequence Modulates Canine Distemper Virus Fusion Protein Function. Virology, 2002 May, 76(9): 4172-4180.

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