RNA干擾技術在養殖業中的應用

趙亞娟 潘樹峰 郭 微

（遼寧省農業技術學校 沈陽 110000）

RNA干擾技術在養殖業中的應用

趙亞娟 潘樹峰 郭 微

（遼寧省農業技術學校 沈陽 110000）

RNA干擾是生物進化過程中遺留下來的一種在轉錄后通過RNA調控基因表達的機制，它是指在真核細胞中引入雙鏈RNA分子從而導致具有序列同源性的基因產生特異性基因沉默(gene silencing)的現象[1]。2001年和2002年RNAi研究連續兩年入選美國《科學》雜志評定的年度自然科學十大突破。目前，RNA干擾技術已成為基因功能研究的有力工具，并在人類疾病模型、基因治療、新藥研發以及畜牧遺傳育種等諸多領域展示了誘人的應用前景。該技術首先在線蟲和果蠅等低等生物中取得突破，隨之發展成為基因功能研究的有力工具。由于RNAi機制具有超越疫苗和抗病毒藥物的諸多優點，它也給許多疾病的防治提供了新的思路。

1 RNA i的分子機制

目前關于基因沉默的假說認為,轉錄后水平的基因沉默包括3個階段:起始、維持、信號放大與傳播[2]。

1.1 起始階段 包括dsRNA形成、識別和小干擾RNA( siRNA)片段的產生。由RNA病毒復制機制、 源于轉基因的雙向克隆形成的發夾RNA(hpRNA)和反義RNA (asRNA)等克隆技術均可產生dsRNA[3]，dsRNA被Rde21、Rde24編碼的蛋白識別并引導后，可被二聚體活性形式的Dicer酶從兩端降解成21～23個核苷酸的siRNA[4]。

1.2 維持階段 siRNA與RNA酶形成復合體即RNA誘導沉默復合體(R ISC)，后者具有RNA同源性尋找活性和解旋酶活性以解旋dsRNA，該復合物可被解旋的siRNA激活，鑒別單鏈siRNA序列和降解互補的轉錄產物[5]。生化研究表明，多種蛋白因子涉及RISC的形成。Hannon等報道，在果蠅S2細胞中分離了500 kD的RISC，但沒有活性，而且他們發現，即使最純活性形式的R1SC在體外也不具有靶mRNA的切割能力[6]。提示RISC作用的發揮還需要其他蛋白因子的參與。

1.3 信號放大與傳播階段 siRNA特異性地與mRNA結合后，siRNA作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶作用下通過類似PCR的擴增作用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNaseE樣的Dicer內切酶切割產生次級siRNA，次級siRNA又可以進入下一輪循環。上述形成的siRNA作為信號被鑒別，在RdRp引導下， siRNA作為 dsRNA擴增的誘發子并以ssRNA作模板，將沉默反應放大、增強，在這個過程中，siRNA可能作為一種信號分子在植株中系統傳播，誘導更多細胞啟動PTGS，進一步放大PTGS效應[7]。

2 RNA干擾在動物繁殖中的應用

在動物繁殖領域，RNAi技術主要應用于研究動物生殖細胞發育和動物胚胎發育過程中重要的基因功能及其作用機制。

2.1 RNAi 與動物的生殖細胞發育 Wianny等首次將RNAi技術應用于小鼠卵母細胞研究中，選取在卵泡中表達的c-mos基因作為靶基因，通過顯微注射方式導入dsRNA，結果與對照組基因敲除小鼠實驗結果完全相同，即c-mos基因表達被抑制，細胞減數分裂停滯在MⅡ期，說明RNAi可以用于哺乳動物細胞基因功能研究[8]。Jin Han等用RNAi技術證明了Wee1B蛋白在小鼠卵母細胞中特異性表達，Wee1B蛋白是小鼠卵母細胞中關鍵的特異的促成熟因子(MPF)抑制激酶，是維持減數分裂中止所必需的[9]。Shaoji等首次將RNA干擾技術應用于精子的生成過程中，用電穿孔法向小鼠睪丸內導入外源的報告基因，然后用同樣的方法導入包含siRNA的DNA載體， 發現報告基因的表達量在各個時期均有不同程度的降低，進一步用RNAi 技術沉默小鼠精母細胞形成過程中編碼DNA重組酶的內源性DMC1(Disruption ofMeiotic Control)基因，顯示DMC1基因沉默后，精母細胞發育停滯、不育[10]。

2.2 RNAi與動物的胚胎發育 在發育過程中的不同階段，特異性地消除基因的功能是RNAi 最大優點之一。Wianny等構建了轉基因小鼠檢測體系，該體系在延伸因子-1a(ET-1a)啟動子調控下表達修飾型綠色熒光蛋白(MmGFP)，將MmGFP的dsRNA注入單細胞受精卵，體外培養3～4d后，發現未注射dsRNA的胚胎中大量表達GFP，而注射組只有6.8%表現出微弱的熒光，說明dsRNA可以抑制GFP的表達；但在注入c-mos和E-cadherin的dsRNA單細胞受精卵中，GFP表達并不受影響，說明dsRNA具有抑制的特異性。Haraguchi等在小鼠受精卵原核中注射Oct4基因的 siRNA表達載體，體外培養到囊胚期階段檢測到Oct4基因mRNA和蛋白質表達水平的下降，且胚胎發育阻滯在囊胚期[11]。

3 RNA干擾在動物傳染病預防上的應用

3.1 RNAi與口蹄疫的預防 Kahana R等[12]利用生物信息學的方法分析了所有已發表的FMDV序列，設計出3個至少22bp的siRNA片斷，對所有FMDV都具有100%親和性。應用實時定量PCR檢測感染細胞中病毒RNA的總量，表明利用siRNA處理的細胞病毒增殖被抑制。當利用3種siRNA的混合物處理細胞時，對病毒的生長產生100%的抑制作用。Liu M等[13]證實，轉染siRNA后12h內可以使BHK221細胞系FMDV的效價下降10倍～1000倍，且可持續到轉染后第6天。用高感染復數FMDV接種L基因的siRNA表達盒轉染的BHK細胞，24h后用間接免疫熒光方法檢測。結果表明，表達載體極大地抑制了口蹄疫病毒在BHK細胞中的復制，該抑制作用具有序列特異性，并降低了BHK細胞的死亡率。

3.2 對流感病毒的干擾作用 PA/ PB基因、NP基因所編碼的蛋白同樣是病毒復制所不可或缺的因素，選取NP基因和聚合酶基因(PA/PB)中保守序列設計的siRNA，對雞胚和細胞系中A型IV都有顯著抑制作用。使用這些siRNA處理的感染小鼠，IV感染后肺組織中病毒效價明顯降低，并能保護小鼠免于致死量病毒的攻毒[14]。siRNA能保護動物耐過H5/H7等高致病性亞型流感病毒的侵襲。這些結果說明了RNAi是一種控制流感的有效措施。M蛋白參與病毒粒子的裝配和病毒進出細胞的質子通道，慢病毒載體能有效地將M1基因的siRNA轉染到細胞內，造成M1蛋白在轉染細胞內的表達抑制，將其與運載工具一起靜脈注射到小鼠體內可以產生良好的RNAi作用。

4 RNA干擾在抗動物寄生蟲上的應用

疫苗接種被認為是控制寄生蟲的最有效和最持久的根本策略，使用腸道源的分子來構建疫苗抗原已經有效地用于家畜的外寄生蟲，如目前投入市場并商品化用于免疫防治牛的重要吸血性蜱微小牛蜱的Bm86基因工程疫苗。利用H11[15]以及H-gal-GP[16]復合物來免疫防治捻轉血矛線蟲病的策略也非常有效，免疫保護率高達95%。RNAi技術的出現為抗寄生蟲藥物有效靶點的篩選和研究新的疫苗開辟了新的途徑。Marcel o等[17]用RNAi研究布氏錐蟲的Trys基因，發現Trys被抑制后，T(SH2)和GSP被消耗，GSH積聚，細胞H2O2明顯增加，同時伴隨著發育和繁殖受損，因此認為Trys可成為抗錐蟲藥物作用的一個靶點。

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