豬瘟病毒分子生物學診斷的研究進展

季慕寅

(蕪湖職業技術學院,安徽蕪湖 241000)

豬瘟病毒分子生物學診斷的研究進展

季慕寅

(蕪湖職業技術學院,安徽蕪湖 241000)

豬瘟是由豬瘟病毒引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病,嚴重危害我國養豬業。盡管中國很早就研制成功了豬瘟兔化弱毒疫苗,但近年來豬瘟的流行和發病特點發生了很大的變化,很多地區和豬場不斷出現非典型豬瘟、溫和型豬瘟,給該病的診斷帶來了困難。近年來,豬瘟病毒分子生物學診斷方法的研究進展迅速,為豬瘟的快速、準確診斷起到了重要的作用。從聚合酶鏈式反應技術、核酸探針技術、DNA芯片技術等方面對豬瘟病毒的分子生物學診斷方法進行了綜述。

豬瘟病毒;分子生物學診斷;聚合酶鏈式反應技術;核酸探針技術;DNA芯片

豬瘟(classical swine fever)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。它分布范圍廣,危害程度高,給養豬業造成了巨大的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類傳染病,我國農業部動物疫病分類方法中被列為一類動物疫病。豬瘟兔化弱毒疫苗是我國上世紀五十年代研制的世界公認的最優秀的豬瘟疫苗。利用該疫苗,我國成功控制了豬瘟的爆發。近幾年來,原已消滅豬瘟的歐洲一些國家又陸續爆發豬瘟[1],我國豬瘟發病率也不斷上升,并且呈現新的發病特點,主要表現在:從頻發的大流行轉變為無規律的散發性流行;自然病例中常見病理變化不典型、臨床癥狀輕微的非典型或溫和型豬瘟;出現持續性感染、胎盤感染、母豬繁殖障礙以及新生仔豬先天性感染。一直以來,對豬瘟病毒的快速準確的檢測和診斷都是豬瘟綜合防治過程中的難點和重要環節,而豬瘟發病特點的改變給豬瘟病毒的診斷又提出了新的挑戰。由于現在多為溫和型豬瘟,臨床癥狀不明顯,因此現在豬瘟的診斷更多依賴于實驗室診斷。其中,分子生物學診斷技術就是一種快速、有效的診斷方法。它主要針對不同病原微生物所具有的特異性核酸序列和結構進行測定,從而檢測和鑒別病原微生物。近幾年以來,CSFV分子生物學診斷方法發展迅速。本文就CSFV分子生物學診斷方法進行綜述,以期對豬瘟的快速、準確的診斷提供幫助。

1 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術

1.1 反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

RT-PCR診斷技術是從患病動物感染組織中提取總RNA作為模板,應用特異性引物進行反轉錄,產生的cDNA再用聚合酶進行擴增,擴增產物用瓊脂凝糖膠電泳檢測的一種技術。該方法特異性強、敏感度高、重復性好,并且操作簡單、快速,已經廣泛應用于 CSFV的檢測。湯波[2]等建立了針對 CSFVE2基因的PT-PCR檢測方法,對30個樣品進行敏感性、特異性、靈敏度和重復性檢測后證明該檢測方法可以檢測出21株CSFV中的20株,敏感性達95.24%,靈敏度可以達到 8.9pg/μL,重復率在91.1%-100%。此外,該方法不能檢測出牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV),豬細小病毒(PPV),豬呼吸與繁殖綜合癥病毒(PRRSV)等常見豬病病原,說明其具有良好的特異性。Shiu[3]等利用RT-PCR對CSFV臺灣分離株的E1、E2和 E3基因進行了擴增,并將其分別克隆至 PUC19中進行測序,鑒定了該菌株的同源性。胡仁莉[4]等將RTPCR與限制性內切酶圖譜分析方法相結合,快速區別了豬瘟強毒株和流行株。雖然RT-PCR有著不可比擬的優點,但是由于在自然環境中RNA容易降解,RT-PCR結果往往會受到樣品中RNA穩定性的影響,當樣品中病毒含量極微量時,RT-RCR不能達到檢測的目的。

1.2 套式RT-PCR(RT-nPCR)

RT-nPCR是利用兩對PCR引物擴增目的片段的方法,它可以彌補RT-PCR的不足,克服檢測過程中病毒含量低的問題。羅勇[5]等建立了 CSFVRT-nPCR的方法,結果表明其敏感性比普通的RT-PCR提高了100倍。朱小甫[6]等優化了CSFV RT-nPCR,檢測CSFV cDNA的含量可以達到1× 10-7ng/mL。此外,RT-nPCR還提高了PCR的特異性。因為第二對引物是在第一次擴增產物的內部,以第一次擴增產物為模板進行反應。如果第一次擴增產生了錯誤片斷,則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此,RT-nPCR的擴增非常特異。

1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR技術以其高靈敏度、高特異性、便捷快速等優點在病原體的定性和定量方面得到了廣泛應用。溫國元[7]等利用熒光定量PCR法快速檢測樣品中的CSFV,同時將該方法與RT-PCR和RT -nPCR相比較,發現熒光定量PCR具有更高的敏感度,是RT-PCR的100倍。G.T.Fosgate等建立了快速區別CSFV與口蹄疫病毒和瘟病毒屬內其它病毒的熒光定量PCR方法。通過熒光定量PCR對人工感染豬體內CSFV含量進行了動態的監測。熒光定量PCR不僅運用于CSFV的檢測,陳玉棟[8]等還將其與Lightcycler熒光檢測系統相結合,建立了快速定量檢測豬瘟兔化弱毒苗的方法。

熒光定量PCR檢測模式有很多種,在CSFV檢測中主要運用SYBR Green I檢測模式和水解探針模式(Taqman)。Jamnikar[9]等對這兩種模式進行了比較,發現在熒光定量PCR檢測CSFV的過程中,二者表現出一致的特異性,但是由于SYBR Green I檢測模式采用的是通用引物,對非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光,因此其敏感性低于水解探針模式。最近,研究者采用一種新穎的熒光定量PCR檢測模式來檢測豬瘟,即引物探針能量轉移熒光定量PCR(PriProET real-time PCR)。此方法與SYBR法和Taqman法都不同,它是依靠能量轉移產生熒光信號,探針的3′端標記一個受體熒光基團,然后在下游引物的5′端標記供體熒光基團。PCR擴增之后,隨著解鏈溫度的增加,探針和標記有供體熒光基團的擴增子逐漸分離。分析熔解曲線可以證實特異性擴增子的存在。由于探針和擴增子之間的不匹配,可以導致其解鏈溫度低于匹配的解鏈溫度,因此該方法可以用來鑒定CSFV,包括疫苗株。BVDV-1、BVDV -2、BVDV-3和BDV等57個相關病毒進行檢測,結果表明,只能檢測出CSFV,并且試驗的敏感性最小達到20拷貝,此方法為診斷豬瘟提供了一種新的方法。

1.4 多重PCR

多重PCR又稱復合PCR,其反應原理、方法等均與普通PCR相一致,不同之處在于其運用兩對或兩對以上的引物,擴增出多個核苷酸片段,因此適用于臨床大量樣品中病原微生物的檢測。Heidy[10]等針對瘟病毒屬5’端非編碼區域基因和CSFVNS5B基因分別設計了瘟病毒屬特異性引物和CSFV種特異性引物,利用多重PCR,將CSFV與屬內其它病毒相區分,其敏感性可達到0.89TCID50。Yu-Liang Huang等結合實時 PCR,建立了高特異性、快速的CSFV基因分型的多重PCR方法。

2 核酸探針技術

核酸探針技術是在分子標記的基礎上,對已知序列的核酸標記上同位素、地高辛、生物素等,制成探針。根據堿基配對原則,使模板核酸與探針反應。利用酶-底物反應或放射自顯影法,觀察是否出現預期的條帶或斑點,從而做出準確診斷的方法。該方法敏感性高,特異性強,方便快捷,可以從混合標本中正確鑒定出目的病原微生物。利用CSFV基因組RNA構建的cDNA,與BVDV進行了序列分析和比較,合成6個探針,按照它們在病毒基因組的位置,根據特異的雜交條帶可以區別CSFV、BVDV和BDV。

3 DNA芯片技術

DNA芯片又稱為基因芯片、微陣列,屬于生物芯片的一種,是在核酸雜交、測序的基礎上發展起來的。它的出現使快速鑒別大量基因序列成為了可能。隨著技術和設備的日趨成熟,成熟的商品化芯片日益增多,國外已有用于動物傳染病診斷的報道。運用多樣DNA懸液芯片同時鑒別出CSFV和瘟病毒屬的其他病原微生物,敏感性可以達到0.2-10 TCID50/ ml。Douglas[11]等從244000條可以與感染和未感染的巨噬細胞RNA相雜交的探針中篩選出44000條,做成DNA芯片,用來檢測感染CSFV的豬體內巨噬細胞基因表達的變化。

4 環介導的反轉錄—等溫擴增技術(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)

RT-LAMP是由日本學者于2000年建立。它利用6條引物(包括一對外部引物、一對內部引物和一對環引物)利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下,幾十分鐘就可擴增出靶序列。該方法用時短,對設備要求低,且比普通PCR的敏感性高,非常適合于基層和現場使用。Chen等分別用 RT-LAMP和RT-PCR的方法對157份臨床疑似CSFV感染的樣品進行了檢測,結果表明,所有病樣CSFV RTLAMP的陽性檢出率為26.11%,而 CSFV RT-nPCR的陽性率為14.65%,兩種方法之間的符合率為85.35%。此外,RT-LAMP敏感度是RT-PCR的100倍。

5 分子生物學診斷與免疫學診斷方法相結合

隨著現代科學技術的發展,診斷方法的改進正發生著日新月異的變化,越來越多的分子生物學診斷技術與免疫學診斷技術相結合,并被廣泛應用于病原微生物的診斷過程中。為了建立一種敏感、特異、快速的CSFV診斷方法,將RT-PCR與ELISA相結合,使PCR產物在雜交有特異性探針的微孔板上進行ELISA反應,從而鑒別出CSFV。該ELISA-RTPCR方法不僅具有更高的特異性,而且克服了假陽性的可能。

[1]A.J.Peredaa,I.Greiser-Wilkeb,B.Schmitt,et al.Phylogenetic Analysis of Classical Swine Fever Virus(CSFV) Field Isolates From Outbreaks in South and Central America[J].Virus Reseach,2005,110(1-2):111-118.

[2]湯波.豬瘟病毒 E2基因RT-PCR檢測方法的建立及病毒分子流行病學研究[D].重慶:西南大學(碩士學位論文),2009.

[3]Jiun-shan Shiu,Mong-hsiung Chang,Shih-tung Liu,et al.Molecular Cloning and Nucleotide Sequence Determination of Three Envelop Genes of Classic Swine Fever Virus Taiwan Isolate p97[J].Virus Research,1996,41(2):173-178.

[4]胡仁莉.豬瘟分離毒 E2基因序列分析和強弱毒檢測方法的探討[D].揚州:揚州大學(碩士學位論文),2006.

[5]羅勇.豬瘟病毒套式RT-PCR檢測方法的建立和種豬場豬瘟免疫與凈化研究[D].武漢:華中農業大學(碩士學位論文),2009.

[6]朱小甫,張志,李小成,等.豬瘟病毒RT-nested PCR檢測方法的優化和應用[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2007,35(6):11-14.

[7]溫國元,萬超,潘茲書,等.應用熒光定量PCR技術快速定量檢測豬瘟病毒[J].武漢大學學報(理學版),2004,50 (6):746-750.

[8]陳玉棟,張楚瑜,鄒俊煊,等.建立快速定量檢測豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量 PCR技術[J].中國病毒學,2003,18 (2):124-128.

[9]Urska Jamnikar Cigleneckia,Joze Groma,IvanToplak,et al.Real-time RT-PCR Assay for Rapid and Specific Detection of Classical Swine Fever Virus:Comparison of SYBR Green and TaqMan MGB Detection Methods Using Novel MGB Probes[J].Journal of Virological Methods, 2008,147(2):257-264.

[10]Heidy Diaz de Arce,Lester J.Perez,Maria T.Frias,et al. A multiplex RT-PCR Assay for the Rapid and Differential Diagnosis of Classical Swine Fever and Other Pestivirus infections[J].Veterinary Microbiology,2009,139(3-4): 245-252.

[11]Douglas P.Gladue,James Zhu,Lauren G.Holinka,et al. Patterns of Gene Expression in Swine Macrophages Infected with Classical Swine Fever Virus Detected by Microarray[J].Virus Research,2010,151(1):10-18.

Advance of Molecular Biology Diagnosis for Classical Swine Fever Virus

J I Mu-yin
(W uhu Vocational Technical College,W uhu241000,China)

Classical swine fever,caused by classical swine fever virus(CSFV),is an acute febricity contagious disease,which has an important effect on pig-breeding industry of our country.Recently,great changes in prevalence and pathogenesis characteristics of classical swine fever have emerged.The non-typical or mild classical swine fever prevailed in many areas and pig farms,which makes the CSFV diagnosis harder.With the rapid development,molecular biology diagnosis has been widely used in the diagnosis of CSFV.To diagnose CSFV efficiently in clinical,molecular biology diagnosis for CSFV was summed up from Polymerase chain reaction technology,nucleic acid probe technology and gene chip technology.

classical swine fever virus(CSFV);molecular biology diagnosis;polymerase chain reaction(PCR);nucleic acid probe; gene chip

S852.3

A

1009-9735(2010)05-0077-03

2010-09-03

季慕寅(1974-),男,安徽無為人,講師,碩士,高級技師,研究方向:動物傳染病。