冰凍切片防止脫片的幾種方法

王志生 郭海燕

冰凍切片是將組織直接冰凍進行切片,是一種簡便快速的方法,常常用于配合臨床手術等在短時間內制出切片的病理急診[1]。由于冰凍切片組織不需經過酒精脫水、二甲苯透明和包埋等過程,脂肪、類脂質、抗原等化學物質成分不受影響,因此是臨床上常用的制片方法。我們通過實踐摸索出對一些特定的標本:如乳腺組織、卵巢腫瘤、甲狀腺組織、肺癌標本以及喉的切緣標本等在切片過程中總結了一些方法,防止了這些組織在冰凍切片染色過程中常常由于各種原因導致組織易于脫落的難題。

1 材料與方法

1.1 儀器 選用leica CM 1900冷凍切片機首選溫度冷凍室-20℃,冷凍頭-22℃。

1.2 固定液 AAF固定液(70%或無水酒精 85m l冰醋酸 5 m l甲醛 10m l)。

1.3 烤箱 202-OAB型 電熱恒溫干燥箱,設定在 70℃。

1.4 方法 接到標本后(標本以乳腺組織、卵巢腫瘤組織、甲狀腺組織、肺葉切除標本以及喉的切緣標本為例,含有脂肪組織的要盡量剔除脂肪組織)用冷凍頭冷凍標本 1min左右開始切片,掌握冷凍的程度和適宜的切片時機是個較難的問題,因為不同組織所需冷凍切片的時間不同。要在實踐中取得經驗。組織冷凍至變白變硬時即可進行切削,新鮮組織冰凍切片時因組織本身的組織液等粘性物質就能粘貼牢固,但在某些特殊情況下如冷凍過度時的組織酥脆,切出的片子易碎有裂隙甚至呈粉末狀。此時應停止冷凍稍等片刻也可以帶上一次性手套,用手掌或大拇指腹緊貼組織切片面 3～5 s,利用手掌的溫度使組織迅速升溫,并且觀察組織切面變化掌握好時機便能快捷切出完整的切片。此時冰凍切片機轉輪要用另只手固定或鎖死,以防轉輪轉動手被切片刀刮傷。有些組織如乳腺組織、卵巢囊腫的囊壁組織在切片后放入 AAF固定液中,在固定至染色過程中常有因室內溫度過低或載玻片不干凈含有油膩或混入塵污等臟東西等原因使組織從載玻片上脫落現象,此時應換用經防脫膠APES處理后的載玻片進行粘片。若無防脫膠玻片時,用普通載玻片進行粘附后,可以將玻片放入恒溫干燥箱內底板上,此時要使粘有組織的一面朝上,烤片 10 s后拿出在室溫中稍加冷卻后放入AAF固定液中進行固定及染色,此時組織便可以牢牢地粘在載玻片上。

2 結果

用以上方法對組織進行快速冰凍切片,結果顯示此方法簡單,制片時間短,切片質量較好 ,外觀平整,鏡下無皺折,細胞核染色鮮藍色,細胞核內染色質清晰,細胞核與細胞質對比清楚,透明度好。術后診斷符合率達 96%以上,與常規 HE切片染色無明顯差別。

3 討論

3.1 要做好準備工作,刀要鋒利,若用一次性切片刀要定時更換切片。要保證冰凍切片機 24 h處于備用狀態,預定好除霜時間,除霜時間應設在半夜 12點左右。切片刀鋒利組織取材大小要適度,尤其是取材厚度要適當以 3～5mm為宜,取材過厚,冷凍時間要延長,待組織全層凍硬了,則表層過硬則切片易碎或呈粉末狀,如甲狀腺等疏松組織。此時用手掌或指腹貼近組織使組織迅速升溫到適宜溫度,此法方便、快捷,在遇到連續送檢不同質地的組織時避免不斷調整冰凍切片機的溫度,延誤診斷時間。如果組織厚度在 2mm以下經冷凍頭一壓組織變薄,在鎖片過程中容易切到組織冷凍托頭,損壞切片刀。

3.2 在用恒溫干燥箱烤粘切片,時間不能過長以不超過 10 s為宜,否則會使組織干燥影響染色。

3.3 切片手法要熟練 技術員要熟練掌握機器性能和冰凍切片方法,熟悉和掌握不同組織的適宜溫度和其他有關條件,只有在實踐中不斷積累經驗。如含水分較多的疏松組織就容易凍結而含脂肪較多的組織就難以凍結。在同樣條件下前者冷凍快,后者冷凍慢。切片時要適當延長冷凍時間,當觀察組織全部變白即可切片。切片刀的溫度在-20℃左右就能切出比較滿意的切片。冰凍切片在允許的時間內都可以完成,保證質量是前提,并不是越快越好。

3.4 冰凍切片通常比石蠟切片厚,細胞由于未固定往往偏大。在制片過程中要根據不同的組織調節不同的溫度。有時溫度過低會使組織過脆、切片撕裂;帶有脂肪的組織往往難切而引起折疊,有時染色不佳影響觀察或冰凍過度細胞內出現空泡冰晶而誤診。

3.5 術中冰凍切片快速診斷,首先要求臨床醫師盡量提供完整病史和手術所見,準確取材,提出初步診斷意見。病理醫師也要準確取材,不要僅限 1塊,應取 2～3塊為最佳,并要求技術員要認真仔細觀察不斷總結經驗才能制作良好切片,保證冰凍診斷質量。

4 小結

總之,冰凍切片是較難掌握的病理實驗技術之一,要做好一張冰凍切片絕不能只求速度,否則常適得其反[2,3]。為了不漏診、誤診,及時準確地作出診斷,確保結果科學性、正確性、真實性,這就需要醫護人員在進行冰凍切片時應有嚴格的責任心、嚴謹的工作態度、密切聯系臨床、豐富的工作實踐經驗,不斷提高切片質量,總結經驗和教訓,這樣才能更好的為臨床和科研服務。近幾年隨著科學技術的現代化實現,病理學科也引進了許多自動化裝置,如病理標本的自動脫水機,自動包埋機、自動切片機、自動染色機、自動免疫組化機等。并隨著互聯網技術的發展,開展了遠程病理圖文會診,為臨床提供了更便捷、可靠、有效的診斷治療建議。

[1] 于洪藻,李成庫.病理標本制作技術.白求恩醫科大學出版社,1980:72.

[2] 王伯云,李玉松,黃高昇,等.病理學技術.人民衛生出版社,2000:230.

[3] 陳敬彬,楊成斌,劉紅霞.肺部腫物術中冰凍切片誤診原因分析實用醫藥雜志,2010,27(4).