微核實驗方法的比較研究

王宗霞，劉菏月，楊美霞，查 娜，娜布其，阿拉坦其其格

1.包頭醫學院，內蒙古包頭 014040

2.包頭醫學院基礎學院，內蒙古包頭 014040

微核實驗方法的比較研究

王宗霞2，劉菏月1，楊美霞2，查 娜1，娜布其1，阿拉坦其其格1

1.包頭醫學院，內蒙古包頭 014040

2.包頭醫學院基礎學院，內蒙古包頭 014040

微核實驗作為快速檢測體內染色體畸變的方法，以其簡便、迅速、敏感為優點廣泛應用于遺傳、食品、藥物、環境等很多領域.為此，我們對微核實驗染色方法、基本實驗方法與自動化檢測方法進行比較，以提供在不同實驗條件和實驗目的下應選用的方法。

微核；染色方法；實驗方法；比較研究

1 基本染色方法的比較

1.1 基本染色方法

吉姆薩染色法：吉姆薩染液由天青，伊紅組成。與嗜酸性顆粒結合，染粉紅色；與嗜堿性物質結合，染紫藍色；中性物質，染淡紫色。吖啶橙熒光染色法：熒光色素吖啶橙透過細胞膜，使核DNA 和RNA 染色。在熒光鏡下吖啶橙使細胞核呈綠色或黃綠色熒光；凋亡細胞中，吖啶橙使凋亡小體呈黃綠色熒光；壞死細胞黃熒光減弱甚至消失。

1.2 染色時間的比較

染色時間對吉姆薩染色效果有影響，時間太短如染色5min～7 min，整個細胞染成淺紫色，效果不明顯，發生微核的細胞區分不明顯；染色時間太長，則染色太深，會使整個細胞都成深紫色，觀察不出細胞膜和細胞核的邊界和細胞核分成的小核；染色10 min 效果較好，孫華明等[1]在2個不同時間進行Giemsa 染色, 比較了不同時間染色對結果的影響, 結果差異并不顯著。吖啶橙染色的熒光會在短時間內發生淬滅，淬滅會在短時間內對實驗結果有一定影響，所以吳娣等實驗觀測時采用先在鏡下對選定視野進行拍照，再在圖像上進行細胞計數的方法，能夠減少淬滅對結果造成的影響。

1.3 染色方法改進比較

胡冰冰等[2]將丫啶橙顯微鏡法改進，在干凈玻片上滴加AO染液10μL，取骨髓細胞懸液5μl直接滴在染液內,混勻后蓋片,在室溫（11℃～33 ℃）下可立即計數，效果較好。王襄等[3]通過人外周血淋巴細胞的毛細管法，用瑞氏和染色姬姆薩聯合染色（姬姆薩1mL加蒸餾水20mL），瑞氏染色1min, 姬姆薩染10min，效果較好。姚沈明等[4]改進傳統的姬-瑞氏混合染色法，（按姬氏、瑞氏、蒸餾水1：3：10 混合均勻）染色5min, 鏡下可見淋巴細胞漿染成淡天藍色, 胞核微核清晰可辨。 吖啶橙AO 常與溴化乙啶EB 合用雙染，因EB 只染死細胞使之產生桔黃色熒光，由此可區分出正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞。

2 同一種細胞的不同方法比較

李銳等[5]觀察蜘蛛血細胞的微核，采用吉姆薩染色和吖啶橙兩種染色方法進行優缺的比較：吉姆薩染色后蜘蛛血細胞的形態結構清晰，細胞膜和細胞核邊界清楚，能很好的區分核與胞質，呈現出清晰的細胞圖，觀察效果好。吖啶橙染色法，它具有特異性強，檢出率高，不易受細胞形態學變化的影響等特點。即使細胞的數量較少，以常規染色法難以做出診斷的標本，使用吖啶橙染色時，呈現明亮染色的細胞也容易與暗色的背景區別開來，從而做出明確診斷。該方法的不足之處是以熒光染料染色的標本不易保存，難以作回顧性診斷。要求條件較高，只能在實驗室進行。研究結果表明，用吖啶橙染色法的檢出率更高，熒光顯微鏡檢查可見典型的凋亡形態。這種方法不僅可看到細胞的形狀，而且能同時看到細胞核。是一種較好的染色方法。張艷芬等[6]進行Giemsa染色和DAPI方法比較，DAPI是特異性熒光染料，微核清晰可辨用；普通的Giemsa染色，非特異性，不能排除是Giemsa染液中染色顆粒的干擾，所以，不能確切判斷是否為微核。陳秀云等[7]進行Tris-NH4Cl 法和明膠法優缺比較，前者主要是通過低滲溶解作用, 將紅細胞破壞來分離淋巴細胞；后者主要是根據比重原理將淋巴細胞分離出來。Tris-NH4Cl 法抗凝血經過低滲處理后, 再經固定液冰醋酸：甲醇= 1：3，固定后, 涂片中細胞沉渣較少, 視野中淋巴細胞較多, 特別便于顯微鏡下計數, 具有快速、方便等特點，但所需試劑相對較多，成本較高；明膠法細胞形態較完整，所需試劑較少，具有價廉等特點，但操作過程費時，汲取上清液時難免會混入少量的紅細胞，因而在油鏡視野中淋巴細胞相對較少，計數較困難。從對正常人群的測定結果看，兩種檢測方法檢測結果基本相同，表明兩種檢測方法均適用于臨床檢測診斷。所以在進行淋巴細胞微核檢測時,應根據各實驗室的條件進行。沈宗麗等[8]進行細胞松弛素法（CB）與常規法比較，對測得的淋巴細胞微核直徑和微核率作了比較：1）3.1Gy照射, CB法微核率7.517%高于常規6.171%(p＜0.05)；CB法平均微核體積是常規法的1.8倍；2）未照射組中，CB法測的健康人自發微核率0.767%也高于常規法0.492%(p＜0.05)；CB法平均微核體積是常規法的1.6倍。結合文獻資料可認為，CB法在檢測電離輻射的誘變性上較常規法敏感，實際工作中應有選擇地使用CB法。用上述方法，Fenech M測平均MNT,認為CB-MNT比C-MNT敏感。胡冰冰等對流式細胞儀和AO顯微鏡法的結果比較，可以互相應證實驗的準確性。流式細胞儀檢測經X射線處理后的小鼠骨髓紅細胞微核，顯示出良好的劑量及時間依賴性。AO顯微鏡法檢測小鼠骨髓，也呈現出良好的劑量及時間依賴性。用兩種方法檢測所得的小鼠骨髓fMNPCE的全部數據之間具有正相關性。李志等[9]小鼠網織紅細胞微核率變化同時采用PI 和CD71 染色進行流式細胞術檢測和外周血涂片 Giemsa 染色顯微鏡檢測。結果：應用流式細胞術檢測外周血網織紅細胞微核與外周血涂片顯微鏡檢測敏感性相同, 兩者并具有良好的相關性。流式細胞術檢測法能在3min 內完成10 000個網織紅細胞的檢測, 常規顯微鏡檢測1 000個網織細胞至少需20 min。流式細胞術檢測法具有高通量、省時、省力等優勢。

3 不同細胞的同一種染色方法比較

張艷芬等[10]取小鼠外周血、骨髓液和睪丸組織細胞Giemsa染色，分別采用外周血微核檢測方法、骨髓微核檢測方法及睪丸微核檢測方法觀察微核。3種方法中，骨髓微核檢測法微核很易觀察到，實驗組和陰性對照組間有極顯著差異,且方法方便、穩定，Giemsa染色后效果好，清晰且易辨認；睪丸微核檢測法觀察到出現微核的細胞較少，實驗組和陰性對照組的微核發生率只有顯著差異，且Giemsa染色特異性差些,微核不易辨別；實驗組微核發生率骨髓微核檢測方法高于睪丸微核檢測方法；外周血細胞微核檢測方法未觀察到微核。3種方法中骨髓微核檢測方法為最佳。張艷芬對小鼠的股骨和胸骨比較，結果股骨比胸骨好，在收集骨髓細胞時，沖洗骨髓腔比用止血鉗擠出骨髓液取材要好。

4 多種方法檢測多種細胞的比較

胡冰冰等以環磷酰胺處理雄性KM小鼠，分別用丫啶橙、單激光流式細胞儀、姬姆薩法檢測小鼠骨髓及外周血嗜多染、正染紅細胞微核率,將檢測結果進行比較。結果：以前置角散射光（FSC） 和DNA 熒光（FL1）作圖,清晰可見小鼠骨髓細胞被分成5個群體——有核細胞、嗜多染、正染、含微核的嗜多染及正染紅細胞; 環磷酰胺誘導的小鼠骨髓嗜多染及正染紅細胞微核率呈良好的劑量- 反應關系；FCM、快速AO 法與Giemsa 法檢測結果具有良好的相關性。結論：AO-FCM自動化檢測方法完全適用于小鼠骨髓紅細胞微核率的檢測。適用于大批量樣本檢測，對于小批量或小型實驗室檢測，可選擇快速AO 檢測法，該方法與標準Giemsa 法檢測結果相關性很好。

[1]孫華明，等.實驗誤差因素對人雙核淋巴細胞微核結果影 響的研究[J].癌變畸變突變，2007(4).

[2]胡冰冰，等.流式細胞儀檢測X射線誘導小鼠骨髓紅細胞微 核率的初步研究[J].第三軍醫大學學報，2005(2).

[3]王襄，等.毛細管法檢測淋巴細胞微核的結果分析及質量控制[J].職業與健康，2003(7).

[4]姚沈明.淋巴細胞微核染色方法的改進[J].化工勞動保 護，1997(5).

[5]李銳，等.2種染色方法在微核試驗中的比較[J].蛛形學 報，2008(2).

[6]張艷芬，等.小鼠骨髓組織細胞微核DAPI染色法[J].中國 組織工程研究與臨床康復，2008(2).

[7]陳秀云，等.Tris-NH4Cl 法與明膠法檢測外周血淋巴細胞 微核率的比較研究[J].現代預防醫學，2007(10).

[8]沈宗麗，等.培養人淋巴細胞分裂阻滯與常規微核測試法 的比較研究[J].癌變畸變突變，1995(6).

[9]李志，等.不同采樣時間小鼠網織紅細胞微核率變化的流 式細胞術研究[J].現代預防醫學，2005(6).

[10]張艷芬，等.3種微核檢測方法的比較[J].新鄉醫學院學 報，2008(3).

Q93

A

1674-6708（2010）28-0110-02

王宗霞，教授，研究方向：生殖生物學

劉菏月、查娜、娜布其、阿拉坦其其格，專業：臨床醫學，研究方向：生殖生物學

楊美霞 ，講師 ，研究方向 ：組織胚胎學