負載LMP-1基因的樹突狀細胞誘導CTL對鼻咽癌細胞的殺傷效應*

徐瑞鳳, 石 敏, 尤長宣, 呂成偉, 羅榮城, 廖旺軍

(南方醫科大學南方醫院腫瘤中心, 廣東 廣州 510515)

目前,以放化療相結合的綜合治療是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的有效治療手段,但仍有約40%-50%患者出現局部復發和遠處轉移。對于治療失敗的患者,尋找新的治療方法顯得尤為重要。研究表明NPC患者的樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)數目有限,免疫功能低下,無法有效地處理和遞呈腫瘤抗原可能是腫瘤逃避機體免疫監視的主要原因[1]。以DC疫苗為代表的細胞免疫治療給常規放化療治療失敗的NPC患者帶來了希望。然而如何安全、高效的將目的基因轉染DC是制備DC疫苗的瓶頸之一。本實驗探討超聲及微泡造影劑介導基因轉染DC的有效性,并進一步觀察LMP-1為靶點的DC疫苗對LMP-1陽性NPC細胞株C666-1的體外殺傷作用。

1 材料與方法

1 材料與儀器:重組人白細胞介素2(IL-2)、重組人白細胞介素4(IL-4)、重組人白細胞介素7(IL-7)、重組人粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)購自Sigma公司;AIM-V培養基購自GIBCO公司;淋巴細胞分離液購自天津血液研究所;質粒提取試劑盒購自Invitrogen公司;超聲微泡造影劑聲諾維(Sono Vue)為意大利Bracco公司產品。熒光標記鼠抗人單克隆抗體CD80、CD83、CD86、CD40、H LA-DR為美國BD公司產品。綠色熒光蛋白(GFP)質粒pEGFP-C3-LMP-1、NPC細胞株C666-1、Ecoli DH5α菌株由本室保存。儀器:超聲診斷儀為Sequoia 512彩色多普勒診斷儀購自Siemens公司;流式細胞儀FACSCalibur為美國BD公司產品;熒光顯微鏡IX71購自Olympus公司。

1.2 方 法

1.2.1 外周血DC和淋巴細胞(PBL)的分離與培養:無菌抽取人外周血,外周血來自與C666-1細胞HLA配型相近的健康志愿者,采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,培養于6孔板中。貼壁5h后輕輕洗去懸浮細胞,貼壁細胞即為DC的前體細胞,加入含GM-CSF(終濃度為800 U/mL)、IL-4(終濃度為1000 U/mL)的AIM-V 培養基,隔天半換液。第5、6天加入TNF-α(終濃度為100 U/ml),第7天獲得懸浮細胞。上述洗去的懸浮細胞即為PBL,培養于含IL-2(終濃度為20U/mL)的AIM-V培養基中,隔天半量換液。

1.2.2 質粒/微泡造影劑混合物的制備及質粒pEGFP-C3-LMP1轉染DC:使用前向每支微泡造影劑SonoVue中加入5mL生理鹽水,輕輕振蕩混勻,置4℃冰箱靜置30 min。6孔板加入微泡-質粒混合液,其中每孔加入10ul質粒pEGFP-C3-LMP1(1ug/uL)。實驗分為4組:①單純質粒組(A組):加入質粒;②超聲照射組(B組):質粒+超聲輻照;③微泡造影劑組(C組):質粒+微泡造影劑;④超聲+微泡造影劑組(D組):質粒+微泡造影劑+超聲輻照。輻照時探頭放置于培養板下方,加少量耦合劑,使探頭緊貼培養板底部照射。本實驗的超聲照射條件統一設為頻率1.5MHz,機械指數1.0,為照射時間1min,微泡造影劑濃度為20%。另將體外培養的DC分為兩組用于檢測DC表面表型的表達及體外殺傷實驗:①空白對照組,單純培養的DC;②基因轉染組,具體實驗方法同上述D組。

1.2.3 流式細胞儀評價GFP質粒的轉染效率及檢測DC表面分子表型的表達。

1.2.3.1 流式細胞儀評價GFP質粒的轉染效率:上述各種實驗條件處理后的細胞,立即置于培養箱中培養6h后更換為新鮮的AIM-V培養基,分別于12h、24h、48h在熒光顯微鏡下觀察細胞內GFP表達情況并攝片。48h后收集細胞,流式細胞儀檢測各組細胞GFP的表達情況,每組測10000個細胞,GFP陽性細胞的陽性率即為轉染率。

1.2.3.2 流式細胞儀檢測DC表面分子表型的表達:分別取基因轉染組及空白對照組的DC,用流式細胞儀檢測其表面表型 CD80 、CD83 、CD86 、CD40 、H LADR的表達情況。

1.2.4 混合淋巴細胞反應(MLR):上述基因轉染組及空白對照組培養第7天的DC與PBL按1:20的比例混合,培養于含GM-CSF(終濃度為800 U/mL)、IL-2(終濃度為20 U/mL)、IL-7(終濃度為 20ng/mL)的AIM-V培養基,隔天半量換液,共培養7天,獲得CTL。

1.2.5 MTT法測CTL對LMP1陽性的NPC細胞株C666-1的體外殺傷作用:NPC細胞株C666-1培養于含10%胎牛血清的1640培養基的培養瓶中。取對數生長期的C666-1細胞作為靶細胞,另將體外培養的DC分為兩組:①空白對照組,單純培養的DC;②基因轉染組,具體實驗方法同上述D組。將效應細胞與靶細胞按10:1的比例接種于96孔板中,終體積為200 uL。同時設單獨效應細胞和靶細胞對照。效應細胞與靶細胞共培養24h后,每孔加入10 uL M TT(終濃度為5mg/mL),繼續培養4h后收集細胞,1000r/min離心 10 min,棄上清,加入 150uL DMSO,低速振蕩10 min,待藍色結晶物充分溶解后,用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測各孔的吸光值A。CT L殺傷效率=[1-(效靶A值-效應細胞A值)/靶細胞A值]×100%。

1.3 統計學分析:采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析,計量資料以±s表示。組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察GFP在DC內表達:超聲輻照12h后,細胞內開始有GFP表達,熒光強度以48h最亮,以后逐漸減弱,不同組別DC內GFP的表達不同。

圖1 A-D分別為A,B,C,D組DC內GFP的表達情況(×250)

2.2 流式細胞儀檢測轉染效率,見表1。

表1 各組別基因轉染效率的比較(%,±s)

表1 各組別基因轉染效率的比較(%,±s)

注:D組和其余3組間均有顯著性差異(P＜0.01),A、B、C組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

實驗分組 轉染效率A組 2.13±0.43 B組 3.90±0.81 C組 2.41±0.53 D組 14.86±2.36

圖2 A基因轉染組DC表面標志的表達

圖2 B空白對照組DC表面標志的表達

2.3 流式細胞儀分析DC表面免疫表型的表達:FACS結果顯示,基因轉染組成熟DC表面的分子標志 HLA-DR、CD40、CD80、CD83、CD86 的比例分別為 84.70%、49.42%、65.63%、76.78%、82.01%,均高于對照組DC的 61.35%、26.85%、28.05%、32.93%、64.12%(見圖2)。

2.4 致敏DC誘導的CT L對NPC細胞的殺傷作用:基因轉染組的DC所誘導的CT L對表達LMP-1的C666-1細胞有明顯的殺傷作用,其殺傷效率為(41.72±3.53)%,而空白對照組殺傷效率為(7.62±2.36)%,兩組之間差異具有統計學意義(P＜0.01)。

3 討 論

制備DC疫苗的關鍵步驟是如何將基因導入細胞,目前常用的基因載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉染效率較高,轉染后基因表達相對穩定,但病毒自身的免疫原性和潛在的致瘤致畸作用限制了其臨床應用。非病毒載體轉染方法如脂質體轉染法、電穿孔法、超聲穿孔等轉染效率不穩定,但其因安全性較高、耐受性較好、操作簡便、可使基因靶向轉染、藥物靶向釋放而越來越受到青睞。

微泡造影劑的主要成分微泡是由氣體構成的核心和糖類、蛋白質、脂質或多聚化合物構成的外殼組成。在超聲照射下,微泡造影劑破裂所產生的空化效應引起細胞膜通透性增加,促使質粒DNA進入細胞內,從而顯著的提高基因的轉染率[2,3]。微泡造影劑最早被用于心臟血管的顯影,隨著微泡造影劑及超聲造影技術的發展,目前已廣泛應用于肝臟、腎臟、胃腸等器官的顯影。近年來開始在基因轉染及攜帶藥物靶向性治療腫瘤方面進行微泡造影劑的研究。

據報道,超聲聯合微泡造影劑在肝癌細胞、血管內皮細胞、宮頸癌細胞、胰腺癌細胞等多個體外培養的細胞株中成功地促進了基因轉染[4,5]。然而超聲聯合微泡造影劑促進基因轉染DC的研究甚少。本研究探討了超聲聯合微泡造影劑介導基因轉染DC的有效性及與傳統非病毒轉染方法脂質體轉染法的比較。結果顯示裸質粒組、單獨微泡造影劑組、超聲輻照組基因轉染效率較低。當超聲聯合微泡造影劑時,轉染效率則大大提高,和國內外報道相符。Lawrie A等[6]的研究顯示,和裸質粒轉染相比,超聲輻照可使基因轉染效率提高10倍,如聯合微泡造影劑,則基因轉染效率提高3000倍。和既往的研究相比,超聲聯合微泡造影劑介導的基因轉染效率遠遠低于病毒載體,略低于脂質體。但微泡造影劑轉染法有前兩者無可比擬的優勢,即經體表對特定的器官和組織輔以一定的能量照射,微泡造影劑所攜帶的基因或藥物可在體內局部釋放,從而達到靶向性目的,可能會取得更高的殺瘤活性。

成熟DC能有效激活初始型T細胞,處于啟動、調控并維持免疫應答的中心環節。成熟DC的鑒定,除了其典型的形態學外,還需綜合其表面標志CD80、CD83、CD86、CD40 、H LA-DR 等的表達情況。其中共刺激分子CD40、CD80、CD86是成熟DC發揮功能的主要標志。超聲微泡造影劑聯合脂質體介導的基因轉染組 DC表面標志的表達高于空白對照組,其中CD80、CD83、CD86的表達與Ying Pan等[7]的報道基本一致。研究結果說明基因轉染DC后并無影響DC的成熟和DC的功能。

EB病毒(EBV)與NPC的發生密切相關,LMP-1目前被廣泛認為是EBV的致瘤基因,在NPC的發生、發展和轉移中起重要作用[8]。然而LMP-1作為NPC生物治療靶點的研究較少。Gottschalk S等[9]的研究表明LMP-1轉染后的DC可以使鼻咽癌患者外周血中LMP-1特異性的CT L增高500-3800倍,而針對LMP-1為靶點的后續的體外殺傷實驗未見相應報道。本研究選取LMP-1作為轉染基因,結果顯示LMP-1轉染組DC所誘導的CTL對表達LMP-1的C666-1細胞殺傷效率,明顯高于對照組。這一研究結果表明,DC在GM-CSF、IL-4、TNF-α的刺激下及腫瘤抗原的修飾下,發揮了良好的抗原遞呈作用,有效地激活CTL發揮殺傷作用。而空白對照組因沒有腫瘤相關抗原遞呈,從而無法誘導T細胞產生特異性的免疫反應,因而對靶細胞的殺傷效率較低。

綜上所述,本研究結果表明超聲聯合微泡造影劑可增強基因轉染DC,以DC/CT L為基礎的細胞免疫是一種有效的抗腫瘤方法。目前該轉染方法基因轉染效率尚不穩定,對于不同的細胞株、不同的基因轉染效率相差較大,且超聲作用的最佳參數也不盡相同。超聲微泡造影劑用于基因轉染尚處于起步階段,但具有其它基因方法所不具備的優勢。相信隨著超聲作用參數的進一步優化和造影技術的深入研究,超聲聯合微泡造影劑在腫瘤治療中將會有廣闊的應用前景。

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