黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化動態(tài)

徐慶華 胡寶忠 李鳳蘭

（1東北農業(yè)大學成棟學院，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030）

黃瓜（Cucumis sativusL. 2n=2x=14）為葫蘆科一年蔓生草本植物，是重要的蔬菜作物之一。合理的株型是黃瓜高產品種的生育基礎，矮生性狀是理想株型的一個重要方面，大多具矮生性狀的品系抗倒伏能力強，適于密植（胡寶忠 等，2010）；分枝多少是黃瓜的另一個重要農藝性狀，分枝長勢過強，影響主蔓生長，同時也給黃瓜生產管理帶來諸多不便；通過有目的地調控分枝生長以提高開花和結實數量已成為增產的重要手段之一（蔣蘇 等，2009）。目前國內傾向于利用分枝長勢較弱的品系，因此研究分枝性狀對于黃瓜生產中培育出分枝少、長勢弱的品系有一定的意義；國外為了便于利用機器人采收，也有特別選用和培育分枝長勢極強品系的報道（van Henten et al.，2002）。分枝的發(fā)生出現于主莖軸葉片的葉腋中，首先腋生分生組織分化產生腋芽；腋芽再進一步生長發(fā)育形成側枝，但是腋芽有可能迅速地發(fā)育成營養(yǎng)枝或一直保持休眠狀態(tài)直到生長被觸發(fā)，因此分枝的程度不僅取決于腋生分生組織的生長，還取決于腋芽的發(fā)育過程。近年來基于分枝性狀突變體的研究，擬南芥、豌豆、番茄、牽牛花、水稻等作物的分枝性狀的報道和成果較多；由于黃瓜分枝性狀突變體的缺乏，對黃瓜分枝性狀的相關研究鮮有報道。對黃瓜矮化突變體的研究方面，也多集中在矮化形成的機理上（武濤 等，2009），對突變體的分枝性狀很少關注，至今尚未見關于黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化的形態(tài)解剖學報道。本試驗選擇黃瓜矮化突變體D0462為材料，通過觀察D0462的生態(tài)學特點和采用石蠟切片法觀察黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織的分化過程，為篩選合適的黃瓜分枝性狀突變體、進一步開展黃瓜分枝性狀的生理生化和分子水平的研究提供解剖學的依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選用東北農業(yè)大學黃瓜課題組的高代自交矮化品系D0426，以普通蔓生品系D9419為對照。

1.2 供試試劑和儀器設備

番紅、固綠、酒精、二甲苯、甲醛、甘油、中性樹膠等試劑均為分析純，購自哈爾濱嘉實化學試劑公司；展片機（ZPJ-1A）、磨刀機（MDJ-4型）、旋轉切片機（LEICA RM2245型）、恒溫箱（DHP-9162型）、顯微鏡（Motic BA3000）和顯微攝像裝置（Motic Images advanced 3.2）。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣 2008～2010年連續(xù)3 a將供試材料種植于東北農業(yè)大學園藝試驗站連棟溫室。采用隨機區(qū)組排列，3次重復，每小區(qū)20株，株距25 cm，行距60 cm，栽培條件一致。每小區(qū)選15株進行調查。所有性狀都進行單株測定，用Excel 2003軟件進行數據統(tǒng)計和分析。

2010年3月21日子葉出土，從3月23日開始每隔1 d取材1次，共取9次。用鑷子和解剖針從頂端莖尖中小心剝出生長點，迅速放入FAA固定液中。取FAA固定的材料，經系列酒精脫水，石蠟包埋片厚度10 μm，番紅-固綠染色。Motic BA3000顯微鏡觀察、Motic Images advanced 3.2軟件（Motic China group Co.，LTD）照相和測量。

1.3.2 莖尖分生組織分化狀態(tài)的判斷指標 參考張兆軍等（2008）對羊草營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化的研究結果，將莖尖分生組織不同分化時期的形狀分為初生期、伸長期和結節(jié)期。判別依據:① 初生期。莖尖分生組織的寬度和長度相近，后一個原基突起的出現是在前一個原基（幼葉）已經超過了莖尖分生組織的頂部，且后一個原基的生長方向較上豎，與莖尖分生組織的中軸成銳角。② 伸長期。莖尖分生組織略伸長，后一個原基突起的出現是在前一個原基（幼葉）還沒超過莖尖分生組織的頂部，且后一個原基的生長方向較下垂，與莖尖分生組織的中軸成鈍角。③ 結節(jié)期。莖尖分生組織明顯伸長，在莖尖分生組織表面形成許多小突起。

1.3.3 營養(yǎng)芽莖尖分生組織大小的測量 采用麥克奧迪公司生產的Motic BA300型生物顯微鏡進行成像，莖尖分生組織的直徑、高度測量用Motic Images advanced 3.2軟件進行。各時期的黃瓜營養(yǎng)芽莖尖分生組織直徑和高度測量方法:在葉原基之上所劃橫向直線為莖尖分生組織直徑，與橫向直線垂直的最大縱向直線為莖尖分生組織高度。黃瓜營養(yǎng)芽莖尖分生組織的初生期、伸長期和結節(jié)期的大小為測量36個完好圖片的平均值。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學觀察

3 a的田間調查結果顯示，D0462和D9419兩個品系的黃瓜在株高、分枝性狀和葉面積等方面有明顯的差異（圖版I-1～4、表1）。

表1 供試黃瓜品系形態(tài)學比較

圖版I 黃瓜形態(tài)學觀察

D0462營養(yǎng)芽常著生于花序軸（簇）之上（圖版Ⅰ-5），營養(yǎng)芽一旦形成都能夠伸長形成側枝，不存在休眠或抑制伸長的現象；第1側枝起始節(jié)位為第1～2節(jié)，隨后每節(jié)都萌發(fā)出側枝；四葉一心期幼苗（圖版Ⅰ-6）第1節(jié)就可觀察到花（序）芽，花芽發(fā)育正常（圖版Ⅰ-7）；成熟植株花器官正常，葉腋處花芽最多可達22個（圖版Ⅰ-8），果實短棒狀（圖版Ⅰ-9），植株自封頂（圖版Ⅰ-10）。

D9419植株第1側枝起始節(jié)位為第8～9節(jié)，葉腋處會出現營養(yǎng)芽。但是營養(yǎng)芽的著生位置與D0462不同，直接著生于葉腋部位（圖版Ⅰ-11）；花器官正常，果實長棒狀（圖Ⅰ-12），非自封頂。D9419四葉一心期幼苗第1節(jié)位無營養(yǎng)芽和花芽分化（圖版Ⅰ-13）。

2.2 顯微解剖觀察

結合莖尖分生組織分化判別依據，石蠟切片法觀察D0462和D9419兩個品系莖尖生長的動態(tài)過程，結果顯示:莖尖的生長分為營養(yǎng)生長和生殖生長。D0462和D9419兩個品系莖尖營養(yǎng)生長經歷 3個時期:① 初生期。莖尖分生組織的寬度和高度相近，葉腋分生組織逐漸發(fā)育成側芽原基，側芽原基發(fā)育成幼葉前生長方向與莖尖分生組織的中軸成銳角（D0462見圖版Ⅱ-1～2；D9419見圖版Ⅱ-10～12）。② 伸長期。莖尖分生組織寬度和高度都略伸長，但高度伸長的更多，后一個側芽原基突起的出現是在前一個側芽原基還沒超過莖尖分生組織的頂部，且后一個原基的生長方向與莖尖分生組織的中軸成鈍角（D0462見圖版Ⅱ-3～5；D9419見圖版Ⅱ-13～15）。③ 結節(jié)期。莖尖分生組織高度明顯伸長，在莖尖分生組織表面出現小突起（D0462見圖版Ⅱ-6；D9419見圖版Ⅱ-16～17）。

雖然D0462和D9419兩個品系莖尖生長都會經歷上述3個時期，但是分化進程不一樣（表2）。D0462在營養(yǎng)生長的3個時期分化比D9419快:① D0462的莖尖分生組織進入伸長期（3月27日）比D9419（3月29日）早2 d；② D0462的莖尖分生組織進入結節(jié)期（4月2日）比D9419（4月4日）早2 d，并且D0462的部分結節(jié)期的莖尖由營養(yǎng)頂端轉變?yōu)樯稠敹耍c前期相比，頂端變成伸長的圓頂形，進入生殖生長（圖版Ⅱ-6）；③ D0462的莖尖從4月4日開始分化苞片和花原基，開始花序分化（圖版Ⅱ-7），4月6日已經可以明顯看到花芽的分化（圖版Ⅱ-8～9），截至4月8日D9419的莖尖分生組織未轉變?yōu)樯稠敹恕⑽催M入生殖生長階段（圖版Ⅱ-17）。

表2 D0462和D9419莖尖分化進程比較

2.3 矮化突變體D0462莖尖分生組織不同分化時期的大小

由黃瓜矮化突變體莖尖分生組織不同分化時期大小的測定結果得出（表 3）:初生期莖尖分生組織直徑平均值為148.2 μm，最小值和最大值分別為167.3 μm和202.7 μm；高度平均值為105.8 μm，其最小值和最大值分別為89.0 μm和118.0 μm；直徑與高度的比值為1.40，初生期的莖尖分生組織是直徑大于高度。伸長期莖尖分生組織的直徑平均值為 153.1 μm，最小值和最大值分別為 133.6 μm和175.3 μm；高度的平均值為 197.5 μm，最小值和最大值分別為158.0 μm和244.8 μm；直徑與高度的比值為0.78，與初生期相比，直徑與高度雖都已增加，但伸長期莖尖分生組織的直徑已小于高度，說明莖尖分生組織高度的發(fā)育速度大于直徑。結節(jié)期莖尖分生組織的直徑平均值為 197.7 μm，最小值和最大值分別為140.2 μm和289.0 μm；高度平均值為 360.0 μm，最小值和最大值分別為 260.0 μm和 600.1 μm；直徑與高度的比值為0.55，莖尖分生組織的直徑和高度在繼續(xù)增加的同時，結節(jié)期莖尖分生組織高度的增加速度在進一步加快。

圖版II 黃瓜莖尖分生組織分化的動態(tài)顯微觀察

表3 矮化突變體D0462營養(yǎng)芽莖尖分生組織不同分化時期的大小

3 結論與討論

蔣蘇等（2009）研究黃瓜無側枝品系S61的形態(tài)解剖學觀察時指出，無側枝品系S61的營養(yǎng)芽著生于花序軸上，S61所有的側枝都是由花序逆轉而來；而有側枝品系 S06營養(yǎng)芽直接著生于葉腋部位。本研究發(fā)現少分枝的D9419營養(yǎng)芽直接著生于葉腋部位；多分枝的D0462營養(yǎng)芽常著生于花序軸（簇）之上，營養(yǎng)芽一旦形成都能夠伸長形成側枝，不存在休眠或抑制伸長的現象。模式植物擬南芥不僅從主莖上分枝，也可從蓮座狀基部產生的腋生花序上分枝（劉進平，2007）。植物分枝性狀會受到各種環(huán)境因素的影響，包括營養(yǎng)、種植密度、光、溫度和水分等，同時還受到植株內源激素的調控；D0462和D9419生長環(huán)境相同的前提下，D0462莖尖分生組織分化進程快、較早進入生殖生長階段是調控分枝性狀的基因表達和內源激素共同調節(jié)的結果。

植物的分枝發(fā)育大致可分為葉腋分生組織（AM）的形成和腋芽的生長發(fā)育。表現出多分枝性狀的擬南芥sps、bushy突變體，其分枝數目增多是由于形成的腋生分生組織數目增多引起的（杜黎明 等，2008）。然而多分枝的 D0462莖尖分生組織營養(yǎng)生長階段的 AM不比少分枝的D9419的AM多，所以推測對D0462多分枝表型調控發(fā)生在腋芽生長發(fā)育階段。目前，植物腋芽生長發(fā)育相關基因和這些基因的上下游基因，以及它們在莖分枝調控的不同遺傳途徑間的相互關系仍未研究清楚，主要原因是沒有足夠的突變體（杜黎明 等，2008）。目前鑒定的腋芽生長相關基因（CCDs）突變體包括水稻的htb1、擬南芥的max和axr1、豌豆的rms等，均表現出分枝數量與植株高度呈負相關的關系（Ishikawa et al.，2005；Simons et al.，2007）。腋芽生長發(fā)育相關基因對黃瓜分枝性狀調控的研究尚未見報道，多分枝、矮化黃瓜D0462的形態(tài)學和解剖學研究可為黃瓜腋芽生長發(fā)育及黃瓜分枝性狀調控機理研究篩選突變體提供理論依據，進一步豐富對植物分枝發(fā)育調控機制的理解。

D0462莖尖分生組織的形狀分為初生期、伸長期和結節(jié)期；3個時期中，莖尖分生組織直徑/高度的值逐漸減小，進入伸長期直徑/高度的值減少得最多，這也是判別莖尖分生組織進入伸長期的主要標準。部分結節(jié)期D0462出現花芽分化，羊草結節(jié)期也有花芽分化（張兆軍 等，2008），所以可通過莖尖分生組織的大小來判斷是否進入成花過程。

溫室中3月17日播種種植D0462，4月2日部分植株的莖尖分生組織進入生殖生長階段，因此D0462是適于溫室、大棚栽培的早熟品系；植株分枝多、矮化、果實短棒狀，適于國外機器人采收并制作腌漬黃瓜。隨著以蔬菜為主題的觀光休閑農業(yè)發(fā)展迅速，利用矮生番茄、羽衣甘藍、葉用甜菜等矮生蔬菜進行盆栽造型，可增添整體觀賞效果，更重要的是增加溫室內降溫效果，調節(jié)空氣濕度（曹華 等，2010）。D0462具有矮生、多分枝、早熟、花芽多等特性，可培育并造型為溫室內矮生蔬菜盆景，增加矮生蔬菜盆景的種類。

曹華，趙景文，徐進，韓亞欽．2010．日光溫室觀光蔬菜樹式栽培技術．中國蔬菜，（11）:42-44.

杜黎明，毛傳澡，毛偉海．2008．植物莖分枝的分子調控．中國生物化學與分子生物學報，24（2）:120-126.

胡寶忠，孟婧，李鳳蘭，胡小梅，袁強．2010．蔓生黃瓜與矮生黃瓜內源激素的動態(tài)變化．中國蔬菜，（10）:40-45.

蔣蘇，蔡潤，潘俊松，何歡樂．2009．黃瓜無側枝品系S61的形態(tài)解剖學觀察及其無側枝成因分析．園藝學報，36（7）:983-988.

劉進平．2007．植物腋芽生長與頂端優(yōu)勢．植物生理學通訊，43（3）:575-582.

武濤，秦智偉，周秀艷，杜西琳．2009．葫蘆科作物矮化突變體的遺傳學及細胞生理學研究進展．中國蔬菜，（24）:1-6.

張兆軍，穆春生，張繼濤，王書靜．2008．羊草營養(yǎng)枝莖尖分生組織的分化動態(tài)研究．中國草地學報，30（2）:28-33.

Ishikawa S，Maekawa M，Arite T，Onishi K，Takamure I，Kyozuka J．2005．Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice．Plant Cell Physiol，46:79-86.

Simons J L，Napoli C A，Janssen B J，Plummer K M，Snowden K C．2007．Analysis of the decreased apical doMinante genes of petunia in the control of axillary branching．Plant Physiology，143:697-706.

van Henten E J，Hemming J，van Tuuijl B A J．2002．An autonomous robot for harvesting cucumber in greenhouses．Autonomous Robot，13（3）:241.