瘤胃酸中毒與NADH輔因子的營養調控

歐陽克蕙 瞿明仁 黎觀紅

瘤胃酸中毒是指反芻動物采食大量易發酵碳水化合物飼料后，導致瘤胃有機酸產生過多，瘤胃pH值的非生理性下降和有毒物質的產生，而引起瘤胃微生物區系失調和消化道瘤胃功能紊亂的一種代謝性疾病。在反芻動物育肥過程中，急性和慢性瘤胃酸中毒仍是困擾經營者的一大關鍵問題（Owens等，1998）[1]。據Martin等（1999）[2]保守估計，每年僅美國的肉牛肥育生產因瘤胃酸中毒造成的直接經濟損失就高達0.6～1億美元。我國也隨著肉牛產業的發展，集約化規模化肉牛養殖數量增加，高精料飼養的肥育肉牛比率越來越大，由之而帶來的瘤胃酸中毒所造成的損失巨大。因此，如何防止反芻動物瘤胃酸中毒倍受關注。

1 瘤胃酸中毒發生機制

目前，大多數學者認為急性酸中毒的發生原因是瘤胃內乳酸產生菌與乳酸利用菌的菌群失調，致使乳酸含量增加而引發的（Krehbiel等，1995；Nocek，1997；Owens等，1998；Enenmark 等，2002）[1，3－5]。而亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis,SARA）則是VFA（揮發性脂肪酸）在瘤胃內過量蓄積所導致（Martin，1998；Oetzel等，1999；Darren，2005；常影，2006）[6－9]，特別是丁酸的過量蓄積（胡紅蓮，2008）[10]。

正常情況下，瘤胃pH值能維持相對穩定。這主要得益于日糧和唾液中堿性物質的中和作用、瘤胃緩沖系統的緩沖作用、瘤胃微生物對乳酸的代謝利用以及瘤胃壁對有機酸的吸收等機制（肖訓軍和孟慶翔，2000）[11]，使得瘤胃的pH值保持在正常的6.2～6.8[12]。Stock 和 Britton（1993），Beauchemin（2007）指出，如果瘤胃內VFA產生、吸收和中和之間的這種動態平衡被破壞，就會造成VFA在瘤胃大量累積和pH值的降低，從而發生瘤胃酸中毒[13-14]。在這些VFA當中，又以丁酸的積累對瘤胃pH值的影響最大[10]。

VFA的產生與日糧類型有密切關系。不同的日糧造成瘤胃微生物代謝過程發生改變，酸代謝的產物也不同（見表1）。

表1 部分飼料酸代謝產物的比較[引自楊鳳（2005）][16]

對羊瘤胃連續監測的結果也顯示，隨著日糧NFC/NDF（非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維）比例提高，瘤胃TVFA（總揮發性脂肪酸）摩爾濃度顯著增加，其中丙酸、丁酸濃度呈現遞增趨勢，而乙酸濃度及A/P（乙酸/丙酸）則呈降低趨勢（胡紅蓮，2008）[10]。這一結果與 Goad 等（1998）、Oetzel等（1999）、常影（2006）[15，7，9]的研究報道是一致的。

乙酸、丙酸、丁酸的酸度相近（pKa分別為4.76、4.87、4.81），因此，三種酸產生和吸收的速率成為其影響瘤胃內酸度的關鍵。據測定，乙酸、丙酸、丁酸在瘤胃內的吸收率分別為92.70%、76.51%和73.90%[10]。當日糧中含有足量的纖維性飼料時，正常瘤胃內酸代謝產物以乙酸為主，較易被瘤胃壁吸收掉。因此，即使乙酸產量的大幅度提高也并不意味著酸中毒危險性的增加（Beauchemin，2007）[14]。但當易發酵的淀粉和糖類飼料比例增加后，瘤胃內酸代謝則以丙酸和丁酸為主產物，較低的吸收率導致瘤胃內酸蓄積而pH值下降。在誘導發生SARA的山羊、閹牛中都發現瘤胃內VFA各組分摩爾比例的這種顯著性變化規律（即丙酸顯著增加、丁酸極顯著增加，而乙酸濃度顯著降低）（Harmon 等，1985；Brossard 等，2004；常影，2006；胡紅蓮，2008）[17-18，9-10]。

乳酸是瘤胃微生物利用底物發酵產生的另一種酸性物質，在正常瘤胃發酵狀態下，乳酸并不是瘤胃發酵的一種重要中間產物，也不被吸收（段得賢，1981）[19]。乳酸濃度的升高，是在瘤胃pH值長期處于較低水平時，瘤胃內乳酸產生菌增加而乳酸利用菌減少所導致。對瘤胃的持續監測可以發現，瘤胃內容物乳酸含量的高峰，是在較晚的時間，即病極期才開始增加（李光輝，1999）[20]。由于乳酸的酸度（pKa＝3.1）遠高于 VFA酸度（pKa＝4.8），因此，乳酸濃度升高導致瘤胃pH值迅速下降，發生急性瘤胃酸中毒。

綜上所述，飼喂大量易消化的碳水化合物飼料，是瘤胃酸中毒的啟動環節[20]。瘤胃微生物代謝失衡，酸代謝產物的改變，導致瘤胃內有機酸動態平衡喪失，是造成瘤胃酸中毒的直接原因。

2 瘤胃酸中毒的營養調控措施

科學的飼喂制度和正確的日糧配比，如控制易發酵碳水化合物的比例和保證有效中性洗滌纖維（eNDF）是防止瘤胃酸中毒發生的根本措施。除此之外，在日糧中添加一些物質也可對瘤胃酸中毒進行營養調控。

2.1 添加緩沖劑

日糧中添加一定量的緩沖物能夠起到穩定pH值的作用，常用的緩沖物質有：碳酸氫鈉、氧化鎂和碳酸鈣。它們可通過提高瘤胃液的流速、中和瘤胃產生的部分有機酸或者兩方面結合來發揮緩沖效應，達到阻止瘤胃中有機酸的積累，預防瘤胃酸中毒的目的。目前最常用的做法是在肉牛精料中添加0.8%～1.5%的碳酸氫鈉。伍一軍等（1991）報道[21]，添喂NaHCO3+MgO能防止瘤胃液pH值下降，它雖然不能明顯改變奶牛瘤胃氨氮濃度和TVFA濃度，但能增加瘤胃乙酸比例，降低丙、丁酸比例，且能抑制瘤胃內乳酸的產生。但也有些研究指出，添加碳酸氫鈉在育肥早期能有效地減輕酸中毒，而在以后則效果不明顯或完全無效[11]。同時，碳酸氫鈉在使用過程中存在增加拌料麻煩，降低磺胺類藥物的藥效，以及可能因產生過多二氧化碳而引發繼發性酸中毒等缺點。

2.2 添加離子載體類抗生素

一些離子載體類抗生素可以抑制某些乳酸產生菌的生長和降低采食量的變化范圍，從而降低因消化功能紊亂而引起動物的死亡率（Cooper等，1996）[22]。莫能霉素是目前反芻動物肥育過程中使用最廣泛的一種抗生素。大量的研究表明，莫能菌素能有效降低乙酸/丙酸比例和蛋白質在瘤胃內降解為氨的比例（Yang等，1993）[23]，并通過降低揮發性脂肪酸和乳酸的產生量來提高瘤胃pH值，減少瘤胃酸中毒的發生（Bergen等，1984）[24]。實際生產中，精料中添加30mg/kg莫能菌素可降低瘤胃酸中毒的發病率。當然莫能霉素對飼料利用也有負面效果，例如抑制了纖維分解菌對粗飼料的降解（Busquet，2005）[25]。另外，抗生素的殘留以及抗藥性的問題，使得抗生素將被逐漸禁用（2006年1月1日起歐洲已禁止在飼料中使用抗生素）。

2.3 添加電子受體

蘋果酸、延胡索酸（富馬酸）和琥珀酸等有機酸是瘤胃內重要的電子受體，是瘤胃微生物發酵生成丙酸的中間產物（Martin，1998）[6]。與抗生素相反，這些有機酸的作用是促進乳酸利用菌對乳酸的利用，從而預防瘤胃pH值的下降，避免了酸中毒的發生，其中以蘋果酸效果最為顯著。Martin等（1999）給育肥期肉牛飼喂80%精料水平日糧，分別添加4、8、12 mmol/l三種不同濃度蘋果酸，發現三種處理飼喂2～4 h內，瘤胃pH值均高于不添加蘋果酸組。同時還發現隨著蘋果酸添加量的上升，瘤胃pH值和乙酸含量升高，總VFA產生量下降，丙酸、丁酸、L－乳酸含量以及乙/丙比例均沒有明顯變化[26]。此外，蘋果酸等可被微生物利用，無殘留。但是蘋果酸的價格昂貴，生長育肥牛每天按添加80 g/頭計，需增加成本0.18美元/頭，從而限制了有機酸在生產中的應用。

2.4 接種益生菌

益生菌主要是一些細菌、真菌及其培養物，在單胃動物中使用普遍，在反芻動物中使用較少。研究發現，通過給病牛瘤胃接種健康牛的瘤胃液、乳酸利用菌、產乳酸菌都可以改善瘤胃發酵。其機制是與乳酸產生菌S.bovis（牛鏈球菌）競爭葡萄糖、麥芽糖等發酵底物，抑制S.bovis的生長，從而減少乳酸的產生量，如埃氏巨型球菌[27]；或者將乳酸和葡萄糖轉化為乙酸和丙酸，如丙酸菌和丙酸桿菌[28-30]。真菌如酵母能清除瘤胃中過量的氧氣，從而為厭氧細菌提供有利的生存環境，促進瘤胃微生物的發酵。體外模擬研究表明，當日糧中含大量易發酵碳水化合物時，S.cerevisiae（啤酒酵母）能與S.bovis競爭葡萄糖，從而減少其乳酸的產量，同時，S.cerevisiae可以促進乳酸利用菌如S.ruminantium（反芻獸新月單胞菌）對乳酸的利用能力[31]，其原因可能是其含有雙羧酸（如蘋果酸）或其他生長因子（張耿等，2005）[32]。但是，目前尚不清楚的是，在瘤胃微生物激烈竟爭的環境中，接種微生物能否在瘤胃長期存活并發揮改變瘤胃微生物區系的作用。

2.5 使用植物提取物

使用植物提取物調控瘤胃的發酵，是目前反芻動物營養研究的熱點（Busquet等，2006）[33]。例如黃蓮（張元慶等，2007）[34]和肉桂（Busquet等，2005）[35]等提取物都可調控瘤胃發酵，提高瘤胃pH值。這可能是其中的精油對瘤胃內某些微生物的選擇性抑制作用（Cardozo等，2006）[36]。而植物中的皂角苷則會通過破壞細胞膜從而抑制原蟲和革蘭氏陽性菌的活性，而使革蘭氏陰性菌在瘤胃內環境中大量繁殖，從而造成丙酸的積累，影響瘤胃發酵類型（Busquet等，2006；Lila等，2003）[33，37]。但這些研究目前還以體外培養的方法為主，迫切需要開展動物試驗。而且由于植物物種和提取工藝的差異，以及動物種類或飼糧類型的不同，使得這些試驗結果變得不確定。

3 NADH輔因子與瘤胃酸中毒的營養調控

由前所述，瘤胃酸中毒的根本是瘤胃微生物代謝失調所造成的瘤胃內酸代謝失衡所致。因此，調控瘤胃內微生物代謝，控制瘤胃內酸代謝途徑和速度，減少乳酸和丁酸的濃度，是防制瘤胃酸中毒的根本措施。然而，瘤胃內酸代謝是一個綜合的、復雜的微生物代謝網絡。由于瘤胃微生物的數量多而復雜，甚至有些微生物是我們目前還未知的，要確切地了解整個瘤胃微生物代謝網絡并進行調控十分困難。單純增加或減少某一種微生物、某一種代謝產物，調控某一種關鍵酶活性，對整個瘤胃微生物酸代謝網絡所產生的影響難以確定。

本世紀以來微生物代謝工程興起了一個重要分支——輔因子工程。即通過調節微生物胞內一些關鍵輔因子的形式與濃度，來改變和優化微生物細胞的代謝功能，定向控制代謝流的方向。這種在輔因子層面上調控碳代謝流的策略，甚至比改進微生物代謝網絡中若干節點處的酶活性對碳代謝流的影響更為有效（Hugenholtz等，1999）[38]。作為碳代謝和氮代謝的關鍵輔因子，輔酶ⅠNAD＋/NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）是最受關注的一對輔因子。通過調整胞內NAD（＋/H）濃度及NAD＋/NADH的比例，會對整個代謝網絡產生極大的影響（Ying，2006；王桂蘭等，2009）[9，40]。例如，荷蘭的Hugenholtz等在乳酸乳球菌（Streptococcus lactis）發酵過程中，通過提高NAD＋/NADH比例，使S.lactis由同型發酵迅速轉入異型發酵，產物由單一的乳酸變為乳酸、乙酸和乙醇（de Felipe等，1998）[41]。張鐵丹（2008）在用Lb.Paracasei（副干酪乳桿菌）發酵生產L-乳酸的過程中，發現乳酸的生成速度隨NADH的濃度增大而增大，當NADH濃度增大到0.2 mmol/l后，體系的反應速度趨于平緩[42]。這些研究表明，NADH可對微生物細胞內的有機酸代謝路徑和代謝速度進行有效調控。

那么，NADH對瘤胃微生物酸代謝有沒有調控作用？許多學者發現，在應激和高產奶牛日糧中添加NAD＋前體——煙酸，可提高奶牛產奶量（Jaster等，1983）[43]。添加一定量煙酸可促進育肥牛盡快適應育肥期日糧，顯著提高日增重與飼料利用率，在高精料飼糧中添加煙酸能提高公牛和羔羊的生產性能（李新建等，2006）[44]。我們的實驗也表明，在育肥肉牛高精料日糧（精粗比8：2）中單獨添加400mg/kg干物質的煙酸，所取得的效果與添加1%碳酸氫鈉的對照組差異不顯著。另有研究表明，添加酵母可緩解瘤胃酸中毒，也可能是因為酵母中含有豐富的煙酸，可大量生成NAD＋（Martin等，1992；Chaucheryras等，1995）[45-46]。

NADH輔因子調控瘤胃微生物酸代謝的機理，目前仍然不是十分清楚。根據目前的研究，NADH輔因子調控瘤胃微生物酸代謝可能的機理如圖1所示。

圖1 NADH與瘤胃酸代謝的關系（瞿明仁等，2010）

4 展望

通過營養措施調控瘤胃發酵，防止瘤胃酸中毒發生，是提高反芻動物生產性能的重要手段。由于抗生素和化學添加劑的致畸、致癌、致突變作用，藥物殘留等問題，以及歐盟禁用抗生素法令的頒布實施，尋找新的天然替代品，采用更有效的方法調控瘤胃的發酵將成為反芻動物營養的研究熱點。

21世紀以來，以NADH等輔因子手段調控復雜微生物代謝網絡的技術方法在工業發酵上的研究越來越多，應用也越來越廣。借助NADH輔因子調控手段對龐大復雜的瘤胃微生物代謝網絡進行調控，將有助于我們從生化角度進一步理解瘤胃酸中毒的發生機制，并采取更有效的方法防制瘤胃酸中毒，其研究與應用前景十分廣闊。

但是，與單純的工業發酵相比，由于瘤胃微生物種類更多，代謝路徑更復雜，采用NADH輔因子調控手段，對瘤胃酸代謝進行調控，還有許多工作要做，有許多困難要克服，因此，希望廣大科技工作者共同努力，攻克瘤胃酸代謝調控的難題，為豐富和發展反芻動物營養理論作出自己的貢獻。

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