α-酮戊二酸對脂多糖刺激仔豬血液生化指標、血液激素水平和炎性細胞因子水平的影響

王 蕾 侯永清 丁斌鷹 劉玉蘭 朱惠玲

仔豬斷奶日齡越早，免疫系統功能越低，越易受病原體的感染。當斷奶仔豬在病原體和非病原體等大分子物質的刺激下，免疫系統活化，被激活的單核巨嗜細胞系統會釋放出一系列細胞炎性因子（如IL-1、IL-6、TNF-α），這些細胞因子不僅是參與免疫防御的主要活性物質，使動物處于免疫應激狀態，而且能通過改變體內激素水平或對靶組織的直接作用來調節免疫應激過程中機體內養分的代謝[1]，使機體內營養物質從支持生長發育轉向為支持與免疫系統活化有關的過程。日糧中添加α-酮戊二酸（AKG）能在一定程度上改善斷奶仔豬的生長性能[2]。

本試驗研究AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標、血液激素水平和炎性因子水平的影響，旨在探討AKG是否可緩解LPS所導致的應激反應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

α-酮戊二酸（AKG）：市售獸醫藥級產品，純度≥99.0%。

脂多糖（LPS）：Sigma公司提供，大腸桿菌血清型O55:B5。

1.2 試驗動物與試驗設計

選用24頭健康的（24±1）日齡斷奶仔豬[杜×長×大，體重（7.25±0.23）kg]，隨機分成 3 個處理組（空白對照組、應激對照組、AKG組），每個處理8個重復，每個重復1頭豬。各組基礎日糧一致，空白對照組和應激對照組飼喂基礎日糧，AKG組飼喂基礎日糧+1%AKG。試驗期為16 d。于試驗第10、12、14和16 d清晨，禁食狀態下，應激對照組和AKG組仔豬分別腹膜注射80 μg/kg BW的LPS，空白對照組注射相應劑量的滅菌生理鹽水。

1.3 日糧組成

基礎日糧配制參照NRC（1998）豬的營養需要（10～20 kg），基礎日糧的組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成與營養水平（風干基礎）

1.4 飼養管理

豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風，試驗期間豬舍保持溫度為22～25℃。試驗豬在代謝籠中飼養，自由采食，乳頭式飲水器飲水，豬舍定時清掃和消毒。

1.5 血漿樣品采集

分別于試驗第10、16 d注射LPS或生理鹽水后3 h，用肝素抗凝真空管從仔豬前腔靜脈采血，靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液得到血漿，分裝后-80℃保存待測。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 血液常規生化指標

取出冷凍保存的血漿，采用日立7020全自動生化分析儀測定有關生化指標。測定指標與方法如下。

對水利建設單位加強管理，杜絕企業資質外借。各級水利部門要對水利建設企業進行嚴格管理，定期進行檢查，統計企業所參與投標項目及其中標情況，同時根據企業實力核定其能從事的項目建設能力，幫助企業不斷增強自身競爭力，遵守水利建設市場的規則規范。對外借資質的企業，一經發現，必須給予嚴厲處罰，可進行停業整頓或者禁止其1年內參與任何水利工程投標等。

①血漿總蛋白（TP）：雙縮脲法；②血漿白蛋白（ALB）：BCG 比色法；③血漿球蛋白（GLO）：BCG 比色法；④血漿尿素氮（BUN）：酶偶聯速率法；⑤乳酸脫氫酶（LDH）：連續監測法。

1.6.2 血液激素及炎性細胞因子水平

生長激素（GH）、生長抑素（SS）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子（TGF-α）、表皮生長因子（EGF）采用放射免疫試劑盒（北京華英生物技術研究所產品）測定。

1.7 數據處理

試驗數據采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析和Duncan's多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示具有顯著性趨勢。

2 試驗結果與分析

2.1 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響（見表2）

LPS首次應激時（第10 d）：①與空白對照組相比，應激對照組總蛋白含量顯著下降（P＜0.05），應激對照組與AKG組差異不顯著（P＞0.05）。②與空白對照組相比，應激對照組球蛋白顯著降低（P＜0.05），和應激對照組相比，AKG組血漿球蛋白含量有所升高，但差異不顯著（P＞0.05），同時，和空白對照組相比，AKG組差異也不顯著（P＞0.05），介于兩者之間。說明AKG在一定程度上緩解了血漿球蛋白含量的下降。③與空白對照組相比，應激對照組ALB/GLO 顯著降低（P＜0.05），AKG 組沒有差異（P＞0.05）；與應激對照組相比，AKG組ALB/GLO顯著提高（P＜0.05）。

表2 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響

仔豬經4次LPS刺激后（第16 d）：與空白對照組相比，應激對照組球蛋白顯著升高（P＜0.05）、ALB/GLO顯著降低（P＜0.05）；和應激對照組相比，AKG組球蛋白顯著降低（P＜0.05），ALB/GLO 有所升高，但差異不顯著（P＞0.05），同時，和空白對照組相比，AKG組ALB/GLO差異也不顯著（P＞0.05），介于兩者之間。

2.2 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響（見表3）

表3 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響

仔豬經4次LPS刺激后（第16 d）：與空白對照組相比，應激對照組EGF顯著降低（P＜0.001），與應激對照組相比，AKG組EGF顯著升高（P＜0.001）。

3 討論

在LPS應激狀況下，腸屏障受損，大量細菌和毒素經門靜脈和腸系膜淋巴系統進入體循環，導致腸源性內毒素血癥和細菌移位，并可引發炎癥連鎖反應，引起全身炎癥反應綜合征，出現如厭食、嗜睡和發熱等癥狀。LPS通過刺激巨噬細胞（Mφ）合成和分泌白細胞介素（IL）-1、IL-6和 TNF（腫瘤壞死因子）-α 等炎性細胞因子發揮作用[3]。

3.1 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響

血液生化指標的改變是組織細胞通透性發生改變和機體新陳代謝機能發生改變的反映。

仔豬血漿白蛋白由肝臟合成，是機體蛋白質的一個來源，可用于修補組織和提供能量。血漿球蛋白則是源于B細胞轉化為漿細胞后分泌而成，能反映機體的抵抗力，總蛋白則是前兩者之和。總蛋白在一定程度上代表了日糧中蛋白質的營養水平及動物對蛋白質的消化吸收程度。正常狀態下的仔豬這3個指標維持在適度高水平可增強抵抗應激的能力而不影響生長性能。這三個指標降低通常是動物發生應激反應的標志之一，如雞熱應激的情況下，上述三個指標均顯著下降[4]。

本試驗結果表明，仔豬LPS刺激后，應激對照組血漿球蛋白先顯著降低多次刺激后又顯著升高。這說明LPS刺激對仔豬造成很大的應激。當仔豬在受到外界各種抗原（尤以日糧抗原與微生物抗原為主）的刺激，會激發免疫反應，短時間內會產生較高水平的抗體（球蛋白）用于抵制抗原；然而長時間的合成、分泌抗體必然會使日糧中用于生長的營養物質轉向了免疫系統的合成來支持免疫反應，從而影響生長速度，甚至出現病態反應。日糧中添加1%AKG后仔豬血漿中球蛋白水平保持不變（AKG組和空白對照組相比差異不顯著），這說明添加AKG能在一定程度上改善LPS導致的應激反應，提高仔豬機體的免疫功能。這與夏利寧（2004）[5]的研究結果相似。這可能是外源性AKG能作為腸道的能源物質，維持腸道屏障功能，減少細菌易位，促進營養物質吸收，可較好地保證血液中的抗體正常適度的合成和分泌，從而緩解了應激。

3.2 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響

生長激素（GH）是腦垂體前葉分泌的一種激素，是調控生長的核心，GH能促進生長，可促進蛋白質合成，且能調節體內的物質代謝，主要通過抑制肌肉及脂肪組織利用葡萄糖，同時促進肝臟中的糖異生作用及對糖元進行分解，從而使血糖升高。GH可促進脂肪分解，使血漿游離脂肪酸升高，使能量來源由糖代謝轉向脂肪代謝。GH主要受下丘腦分泌的生長激素釋放因子（GRF）和生長抑素（SS）的雙向調節，其中SS是抑制垂體GH分泌的主要下丘腦激素，有資料表明，SS抑制GH的基礎分泌，但只有在應激導致GH分泌過多時才顯著發揮抑制作用[6]。SS的抑制作用最終表現為使機體代謝降低，動物生長受到一定程度抑制。本試驗結果表明，LPS刺激后，各試驗組血漿中GH和SS含量差異不顯著（P＞0.05），顯示AKG對GH和SS的分泌可能沒有影響。AKG能有效緩解LPS刺激對杜長大斷奶仔豬血液IGF-Ⅰ和胰島素水平下降[2]。

表皮生長因子（EGF）廣泛存在于體內眾多組織中，尤以胃腸道為甚[7]，能刺激上皮生長。本試驗首次發現AKG可以促進EGF的分泌（見表3）。本試驗研究發現，LPS刺激可使血漿EGF含量降低，而日糧中添加1%AKG能顯著緩解這種變化。EGF對維持胃腸道結構和功能的完整等方面具有重要作用，原因是EGF能促進腸道黏膜上皮細胞的增殖和分化，增強黏膜對養分的利用，減輕多種因素對胃腸道形態的損害。EGF對腸黏膜屏障的保護可能與其調節谷胺酰胺（Gln）的轉運和小腸對谷氨酰胺的攝取和利用有關。EGF可明顯促進谷胺酰胺的作用，使其發揮最大效用，并可持續刺激小腸蛋白合成[7]。TGF-α（轉化生長因子-α）為EGF的同源物，也作用于EGF受體，是另一種胃上皮生長的調控因子。本試驗研究表明，LPS和AKG對血漿中的TGF-α含量沒有影響（P＞0.05）。

LPS通過作用于機體內的單核巨噬細胞，誘導該細胞合成和分泌多種介質分子，并借助這些介質分子在局部發揮作用，或隨血液播散至機體其他部分而發揮作用。

IL-6和TNF-α是免疫細胞產生和釋放出來的主要炎性細胞因子。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，而幾乎所有器官中均有單核細胞存在。TNF-α不僅能介導LPS的多種生物學效應，而且通過誘導其它炎癥介質的協同作用，擴大其生物學效應，從不同環節在體內產生炎性反應和組織損傷。許多研究結果證實，機體在受到LPS刺激后，體內TNF-α含量升高，這與本試驗結果一致。本試驗表明，與空白對照組和AKG組相比，LPS應激可使TNF-α含量顯著升高，1%AKG可以有效抑制LPS刺激導致的血漿TNF-α含量上升。IL-6是一種具有多種生物學活性的細胞因子，主要由活化的T細胞產生和巨噬細胞產生[8]。IL-6在急性期反應中刺激肝細胞蛋白質合成，是一種內源性致熱源，IL-6感染和組織損傷有關。因此，在感染和組織損傷中IL-6可作為一個預警指標。與Li等（2006）[9]研究結果相似，本試驗發現，LPS應激可使血漿中IL-6水平升高，這可能是LPS刺激使機體免疫反應過度所致。1%AKG可以在一定程度上降低LPS刺激導致的血漿IL-6水平升高。AKG通過有效地促進氨的代謝機制，同時可轉化成谷氨酸家族氨基酸（如合成Gln），從而減輕動物生產過程中的代謝應激，在一定程度上緩解LPS刺激導致的仔豬炎癥反應。

4 小結

LPS刺激導致仔豬產生應激反應，而AKG在一定程度上緩解了LPS刺激導致的應激反應。

[1]Johnson R W,Propes M J,Shavit Y.Corticosterone modulates the behavioral and metabolic effects of lipopolysaccharide[J].The American Journal of Physiology,1996,270(1 Pt 2):192-198.

[2]劉堅，侯永清，丁斌鷹，等.α-酮戊二酸對脂多糖應激斷奶仔豬生長抑制的緩解作用[J].動物營養學報，2009，21（4）：519-524.

[3]Johnson R W,von Borell E.Lipopolysaccharide-induced sickness behavior in pigs is inhibited by pretreatment with indomethacin[J].Journal of Animal Science,1994(72):309-314.

[4]劉鈾，林紅英，羅東君.熱應激對肉雞血液生化指標及內分泌機能的影響[J].湛江海洋大學學報，1999，19（1）：61-64.

[5]夏利寧，陶剛，王鳳英，等.改進型中草藥921合劑結合α-酮戊二酸對斷奶大鼠腸道免疫的影響 [J].新疆農業大學學報，2004（27）：91-95.

[6]范志勇，王康寧，周定剛.生長抑素的作用及調控技術研究進展[J].中國飼料，2003（19）：5-7.

[7]趙允召.表皮生長因子對胃腸道的作用[J].國外醫學：外科學分冊，1993，20（4）：201-204.

[8]Lydyard P M,Whelan A,Fanger M W.Instant Notes in Immunology,Beijing:Science Press(copy),2000.

[9]Li J,Li D F,Xing J J,et al.Effects of β-glucan extracted from saccharomyces cerevisiae on growth performance, and immunological and somatotropic responses of pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide[J].Journal of Animal Science,2006,84:2374-2381.