鉛抗性細菌的篩選及其對鉛活化的研究

王旭梅，盛 楠，王紅旗

（1.北京師范大學水科學研究院，北京 100875；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

鉛在土壤中遷移轉化能力弱、溶解度低，由于人類對鉛的過度開采和使用，打破了鉛在生態循環中的平衡，導致嚴重的全球性鉛污染。因此，鉛污染土壤的修復成為目前各國普遍關注的研究內容之一。隨著研究的深入，人們發現超積累植物對沉淀態的鉛無法吸收等缺點，限制了在實際生產中的應用[1-3]。而微生物對重金屬的溶解作用在土壤污染修復中有很多用途，尤其是微生物繁殖迅速，不影響土壤的利用，可以方便地用遺傳手段改造以增強其活力，應用前景廣闊[4-5]。因此，可以提高植物富集土壤中重金屬效能并環境友好的微生物強化措施得以提出。微生物通過自身代謝活動及產物促進重金屬的溶解，提高重金屬在土壤中的生物有效性，促進植物對重金屬的吸收，此外微生物還能分泌植物激素促進植物旺盛生長、增大生物量、提高植物修復土壤重金屬污染的效率[6-7]。

本研究從受重金屬鉛污染的土壤中篩選到2株產酸能力強、對鉛有較強抗性的細菌，并對細菌活化沉淀態鉛的環境影響因子進行分析研究，為供試菌株的實際應用及強化植物富集重金屬鉛等提供理論依據和試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤

土樣1（篩選菌種）：以五點法采集5～10 cm土層樣品，分別取自北京焦化廠和首鋼段永定河岸邊，含 Pb 量在 48～85 mg·kg-1之間。

土樣2：供試土樣采自北京沙河區菜園，土壤主要理化性質為有機質含量1.09%，速效氮含量37.25 mg·kg-1，速效磷 8.56 mg·kg-1，速效鉀 80.21 mg·kg-1，pH 6.8。將供試土樣風干、磨細過100目篩，在32只鋁盒中均等地放入土樣，每盒土樣均為6.00 g，然后于130℃烘箱，干熱滅菌3 h。

1.1.2 試驗藥品

硝酸鉛分析純、碳酸鉛分析純均購自北京市化工技術有限公司。

1.1.3 培養基

有氮培養基：蔗糖 10 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，CaCO30.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，瓊脂20 g。Pb（NO3）2配成 104mg·L-1的溶液單獨滅菌，然后與培養基混合倒平板，Pb2+的濃度分別為100、200、400、800 mg·L-1。液體培養時不加CaCO3和瓊脂[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 鉛抗性菌株分離篩選及初步鑒定

經10倍稀釋法，將10-4、10-5、10-6的土壤稀釋液分別涂布于固體有氮培養基上[9]，28℃恒溫培養2 d，逐步提高培養基中的鉛離子濃度，挑取含鉛量為800 mg·L-1的有氮培養基中生長豐滿的單菌落，隨著不斷移植，雜菌被慢慢淘汰，而得到比較純的菌種[10]，于4℃下保存。將分離所得的菌株活化18 h，接入2%重金屬鉛抗性篩選液體培養基中，搖床培養48 h后用pHS-3C型pH計測定pH，觀察試管底部沉淀態鉛的變化，同時鏡檢。選出兩株pH變化明顯、鉛沉淀物減少、生物量高的菌株（JH13和Y7）作為以下試驗的材料。

1.2.2 菌株JH13和Y7對培養液中沉淀態鉛的活化試驗

在250 mL三角瓶中裝入100 mL有氮液體培養基，加入PbCO30.02 g，使其濃度在鉛全部溶解的條件下：Pb2+為400 mg·L-1，115℃高溫濕熱滅菌20 min。供試菌株接種于以上培養基，在30℃、120 r·min-1搖床預培養2 d，以未接種的重金屬培養液為對照，分別在12、24、48、72 h取樣，用pH計測定接菌培養液中pH，以確定其代謝產酸能力；培養液離心（10 000 r·min-1，3 min）使菌體和未活化的重金屬沉淀，取上清液，原子吸收法測上清液中Pb2+濃度；同時測定對照的pH、Pb2+濃度。

1.2.3 菌株JH13和Y7對土壤中沉淀態鉛的活化試驗

在無菌工作臺上，將稱取的PbCO30.02 g與經過干熱滅菌的土樣2混勻倒入50 mL三角瓶內，共準備32瓶（每個菌種16瓶），每株菌隨機分成4組，每組4瓶。先將以純化的菌株活化18 h，然后接種于50 mL三角瓶中，每瓶接菌6 mL，每組只接種3瓶，另1瓶不接菌，用作對照。培養及測定方法同培養液中鉛的活化試驗，只有培養液離心時間不同（10 000 r·min-1，5 min）。

2 結果與分析

2.1 鉛抗性菌株分離篩選及初步鑒定

從含Pb2+100 mg·L-1的培養基中分離得到19株抗性菌株。逐步提高Pb2+濃度，在含Pb2+800 mg·L-1的培養基中生長良好的細菌共4株。以代謝產酸及活化鉛沉淀物能力強、生長勢及抗逆性強為復篩條件，篩選出2株高效鉛抗性菌株（菌株JH13和Y7），通過形態學特征、生理生化特征等分析[11]，初步鑒定菌株JH13屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）、Y7屬于節桿菌屬（Arthrobacter）。

2.2 抗性細菌對培養液中沉淀態鉛的活化試驗

由圖1、2可以看出，經過搖床培養后兩株菌分別使含PbCO3培養液中的沉淀態鉛發生變化，隨時間的延長，培養液的pH逐漸降低，活化鉛含量逐漸升高，而未經菌液處理的對照培養液中沉淀態鉛含量和pH，基本保持不變。24 h之間，與對照相比，兩株菌對鉛的活化量，都成正比例升高，但24～48 h之間，活化量急劇增加，為前24 h活化總量的2倍之多，此時，培養液的pH急劇降低與活化態鉛的變化成負相關，JH13的pH由6.1降至4.2，Y7的pH由5.9降至4.0。由此可知，供試菌株JH13和Y7對沉淀態鉛有很強的活化效能，其活化作用與供試菌株的代謝產酸能力相關。

圖1 抗鉛細菌JH13對培養液中PbCO3的活化Fig.1 Activation of PbCO3in liquid culture medium by lead-resistant JH13 strains

圖2 抗鉛細菌Y7對培養液中PbCO3的活化動態Fig.2 Activationd developments of PbCO3in liquid culture medium to lead-resistant Y7 strains

由表1可看出，與對照相比， JH13活化鉛含量始終高于Y7，24 h至48 h之間，JH13的活化量大于Y7，但48 h之后，JH13的活化量有所降低，而Y7仍小幅上升。造成這種現象的原因，可能與菌株本身吸附一部分Pb2+或與代謝產物有關。

表1 經抗性細菌處理后上清液中可溶性Pb2+含量Table 1 Concentration of soluble Pb2supernatants through resistant treatment （mg·L-1）

2.3 抗性菌株對土壤中沉淀態鉛的活化實驗

將兩株菌接入含PbCO3的土樣2中，由表2可看出，JH13對沉淀態鉛的活化量高于Y7。由圖3可看出，pH變化曲線與對照相比有較大幅度的降低。由此發現，不論在培養液中還是在土壤中，皆是JH13對鉛的活化量高于Y7、皆是pH變化曲線趨勢逐漸降低，但菌株對沉淀態鉛的活化量始終低于培養液中的活化量。由此進一步說明，菌株對重金屬沉淀態鉛的活化，不僅與代謝產酸有關，還可能與菌體生活環境等有相關性。JH13、Y7對土壤pH的影響（菌體本身的pH基本是穩定的，只能是其活動改變外部環境的pH）。

表2 兩株供試菌株對土壤中沉淀態PbCO3的活化量Table 2 Activation of precipitation fraction PbCO3in soil by two strains tested （mg·L-1）

圖3 兩株供試菌株在土壤中的pH變化曲線Fig.3 Change curve of pH of two bacterial strains tested in soil

3 結論

a.從受重金屬污染場地的土壤中分離篩選出兩株高效活化沉淀態鉛的細菌（JH13和Y7），初步鑒定屬于芽孢桿菌屬和節桿菌屬。

b.分別在培養液和土壤中，投入菌株的活化研究結果研究表明，兩株菌對沉淀態鉛都有很強的活化效能，且活化量高于對照達2倍之多。

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