高效液相色譜法檢測福美雙在蔬菜及土壤中的殘留

孟凡立，崔兆豐，王志坤，李文濱*

（1.東北農業大學大豆研究所，哈爾濱 150030；2.撫遠縣出入境檢驗檢疫局，黑龍江 撫遠 156500）

福美雙是一種具有保護作用的硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，化學名稱為二硫化四甲基秋蘭姆。其抗菌廣譜，對黃瓜霜霉病、番茄、瓜類猝倒病、立枯病、禾谷類白粉病、黑穗病和多種作物的苗立枯病等均有較好的效果，是良好的種子處理劑和土壤處理劑。國外文獻報道的檢測方法中有GC法、GC-MS法、原子吸收法及HPLC-MS法等[1-4]，國內多使用檢測二硫代氨基甲酸酯的水解產物-CS2，即通過酸性水解使福美雙分解為CS2，從而檢測蔬菜中福美雙的殘留量[1-2]。二硫代氨基甲酸酯類殺菌劑根據化學結構的不同可分為3類，分別為二甲基二硫代氨基甲酸酯類（福美雙、福美鐵等）、乙撐雙二硫代氨基甲酸鹽類（代森錳鋅、代森鋅等）和丙烯基雙二硫代氨基甲酸酯類（丙森鋅），此3類物質均可水解產生CS2，故以CS2法進行福美雙殘留量測定缺乏專一性，且測定結果的穩定性和重現性也不好。根據Gustafsson等報道的在福美雙含量分析中采用的衍生化原理[5]，上述3類物質能夠產生不同的衍生產物，因此能夠分別檢測這3類殘留。本研究利用上述衍生原理，建立了福美雙在黃瓜、番茄和土壤中殘留檢測方法，為進行福美雙在復雜基質中的殘留檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100（G1315A DAD）型高效液相色譜儀；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器；申勝R-201型旋轉蒸發儀；SHZ-D（III）型循環水式真空泵；SPS 202F型電子天平；金怡TDL-50臺式大容量離心機；便攜式酸度計（Checker-Hanna Instruments）；渦旋式振蕩器（VTX-3000L）；Millex針頭式過濾器，0.45 μm。

福美雙標樣（純度99%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；L-半胱氨酸鹽酸無水物（99%，上海生工生物工程有限公司）；EDTA二鈉二水合物（99%，Gene-Tech Co.,Ltd.）；四丁基硫酸氫銨（99%，ACROS Organic）；甲醇、乙腈為UV級純；二氯甲烷、正己烷、氯化鈉、碘甲烷等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將采來的土壤樣本去除雜草、碎石等，充分攪拌混勻；黃瓜及番茄樣本先切成片，再經組織搗碎機粉碎后，混合均勻。所有樣本低溫保存（-20℃）。

1.2.2 溶液配制

將100 g·L-1半胱氨酸鹽酸鹽與186.9 g EDTANa2及2 L蒸餾水、36 g NaOH于燒杯中溶解，配制成pH 9.5～9.6的L-半胱氨酸鹽酸鹽和EDTA-Na2混合溶液備用（下稱溶液Ⅰ）；配制含有0.05 mol·L-1碘甲烷的二氯甲烷-正己烷（1：1，體積比）混合溶液備用（下稱溶液Ⅱ）。

準確稱取福美雙標樣0.0505 g（準確至0.2 mg）于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成濃度為1 000 mg·L-1的標樣儲備液，于冰箱4℃儲存。

1.2.3 樣品的提取及衍生化

稱取20 g處理好樣品于250 mL三角瓶中，加入100 mL溶液Ⅰ，密封，室溫條件下（25±5℃）使用空氣浴機械振蕩器在130 r·min-1下，劇烈震蕩10 min轉移至離心管中，再在4 000 r·min-1下離心5 min轉移上清液于250 mL三角瓶中；樣品殘渣再用50 mL溶液Ⅰ渦旋2 min提取，步驟同上，合并上清液于250 mL三角瓶中，攪拌下用6 mol·L-1的鹽酸調 pH 8.0 加 5 mL 0.41 mol·L-1的四丁基硫酸氫銨水溶液，調pH 7.0攪拌下加入40 mL溶液Ⅱ，劇烈震蕩10 min，靜置10 min棄水層，轉移上層有機相于100 mL離心管中，于4 000 r·min-1下離心5 min。棄水層，有機相用少量無水硫酸鈉干燥，上清液轉移至100 mL平底燒瓶中加入5 mL 2-丙二醇-二氯甲烷（1：4，體積比）溶液，于30℃水浴中旋蒸濃縮，殘留物用1 mL甲醇定容，經0.45 μm過濾器后進行HPLC檢測。

1.2.4 儀器條件

色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 m·L-1；進樣量：20 μL；DAD波長選用272 nm；流動相為甲醇-乙腈-水（20：28：52，體積比）；儀器為四元泵配置，采用等梯度流動相洗脫。

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

在1.2.4的色譜條件下，黃瓜、番茄及土壤樣品中福美雙甲基化衍生物的色譜峰與溶劑峰及干擾峰完全分離，結果見圖1～4。化合物的保留時間為6.1～6.3 min。

準確配制 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg·L-1的福美雙標準溶液，按照上述方法（見1.2.3）進行操作。在1.2.4的色譜條件下進樣，并以福美雙衍生物的峰面積-福美雙濃度繪制標準曲線。線性回歸方程為y=26.611x-7.9339，r2=0.9996。可見在1～50 mg·L-1范圍內響應峰面積與藥物濃度呈良好的線性關系。

圖1 福美雙標樣的液相色譜Fig.1 HPLC chromatogra h of thiram standard sample

圖2 土壤空白及0.5 mg·kg-1福美雙標樣添加液相色譜Fig.2 HPLC chromatograph of blank soils sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

圖3 黃瓜空白及0.5 mg·kg-1福美雙標樣添加液相色譜Fig.3 HPLC chromatograph of blank cucumber sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

圖4 番茄空白及0.5 mg·kg-1福美雙標樣添加液相色譜Fig.4 HPLC chromatograph of blank tomato sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

2.2 精密度、準確度和重現性

采用同一供試樣品溶液，在相同色譜條件下，連續進樣5次，測定其峰面積，多次測定的峰面積相對標準偏差為1.7%，說明本方法有較好的精密度。

在空白樣品中準確加入一定量的福美雙標準品，按同樣的操作步驟進行提取、衍生、測定，計算回收率，結果見表1。在黃瓜、番茄和土壤中福美雙的添加濃度在0.05～2.0 mg·kg-1范圍內，平均回收率分別為74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，變異系數分別為 0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在農藥殘留測定所允許的范圍內（回收率：70%～120%，變異系數≤15%），表明該方法準確度和重現性滿足殘留分析要求。

表1 樣品中福美雙標樣添加回收率結果（n=5）Table 1 Average recovery and relative standard deviation of thiram in samples at 0.05～2.0 mg·kg-1fortification level(n=5)

分別以噪音信號的3倍和10倍確定方法的最低檢出限（LOD）為 0.02 mg·kg-1，最低檢測濃度為0.05 mg·kg-1（均以福美雙含量計）。

3 討論

目前國內關于福美雙在蔬菜或土壤中的殘留檢測方法主要有分光光度法（商檢行業標準SN 0525-1996）、GC-CS2法（地方標準 DB11/T 379-2006）、二氯甲烷萃取法[6-8]。其中分光光度法檢測存在假陽性情況，且檢出限過高（0.3 mg·kg-1）已不能滿足當前福美雙殘留檢測要求。GC-CS2法最低檢出限為0.005～0.02 mg·kg-1，但是由于 CS2在食品（如大米、蔬菜等）及土壤樣本中普遍存在，這會嚴重干擾福美雙痕量殘留的定量檢測。二氯甲烷萃取法操作較簡便，但經研究表明，二氯甲烷萃取過程中乳化嚴重，且回收率偏低（＜70%）。本方法利用福美雙在堿性EDTA-Na2溶液中降解，再經甲基化處理，最后由HPLC測定該甲基化產物，方法簡單、可靠。我國規定二硫代氨基甲酸鹽（酯）類殺菌劑在果蔬中最大殘留限量（MRL）為 2 mg·kg-1，歐盟為 0.5～3 mg·kg-1，該方法均滿足檢測要求。

4 結論

本試驗采用甲基衍生化-HPLC法，建立了福美雙在蔬菜及土壤中的殘留檢測方法，方法回收率為74.3%～101.8%，變異系數為0.7%～6.3%，符合我國農藥殘留檢測要求。本方法無需復雜的凈化處理，直接使用液相色譜檢測，即可達到殘留分析的目的，且簡單易行，結果可靠。

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