金邊瑞香插穗形態(tài)、POD與可溶性蛋白含量變化研究

高 柱，王小玲，余發(fā)新，孟偉偉，李彥強(qiáng)

（江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330029）

金邊瑞香（Daphne odoravar.marginataMak）為瑞香科瑞香屬木本植物[1]，是一種市場(chǎng)前景廣闊的年銷花，以扦插繁殖為主。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)生根物質(zhì)促進(jìn)或抑制金邊瑞香扦插生根的報(bào)道很多[2-6]，但有關(guān)金邊瑞香扦插生根過(guò)程中生理生化指標(biāo)變化規(guī)律的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。可溶性蛋白為細(xì)胞生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，與植物的形態(tài)發(fā)生有關(guān)，部分蛋白可作為誘導(dǎo)物，能夠激活與生根有關(guān)基因的活性，產(chǎn)生新的功能蛋白促進(jìn)生根[7]；過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）參與植物體內(nèi)多種生理生化過(guò)程，與植物不定根的發(fā)生和生長(zhǎng)有密切關(guān)系，是重要的植物生根關(guān)聯(lián)酶[8]，Garspar等研究認(rèn)為，POD可作為生根的標(biāo)志之一[9]。本試驗(yàn)研究了不同濃度的萘乙酸（Naphthylacetic Acid，NAA）處理金邊瑞香插穗后，插穗形態(tài)變化、插穗基部POD和可溶性蛋白含量的變化規(guī)律，并分析了POD和可溶性蛋白與金邊瑞香插穗生根的關(guān)系，為金邊瑞香生產(chǎn)和生根機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取3年生金邊瑞香當(dāng)年萌生的健壯半木質(zhì)化枝條，截取6～8 cm長(zhǎng)，插穗保留2～4片上部葉片，用800倍液多菌靈浸泡10 min，晾干后，在NAA溶液濃度分別為 300、500、600、800 mg·L-1中浸泡5 min，清水浸泡為對(duì)照（CK）。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查及取樣方法

試驗(yàn)于江西省科學(xué)院優(yōu)質(zhì)植物種苗繁育基地進(jìn)行。每個(gè)處理150根插穗，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。自扦插之日起，每隔8 d取樣1次，直到生根為止。每次隨機(jī)抽取5株，用于形態(tài)觀察和生理指標(biāo)測(cè)定。取樣時(shí)先把插穗清洗擦干，剝?nèi)』? cm韌皮部，用液氮低溫速凍，做好標(biāo)簽放于超低溫冰箱備用。

1.2.2 樣品提取

稱取樣品0.1 g，加少量CaCO3和1 mL蒸餾水，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，用蒸餾水分次沖洗研缽，定容至10 mL，6 500 r·min-1離心5 min，上清液即為樣品液。

1.2.3 POD活性及可溶性蛋白含量測(cè)定

POD活性測(cè)定采用比色法；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[10]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

愈傷發(fā)生率（%）=有愈傷組織株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

變褐率（%）=插條變褐株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

腐爛率（%）=腐爛株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

皮層開(kāi)裂率（%）=皮層有開(kāi)裂株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

生根率（%）=生根株數(shù)/插條根數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003制圖，SPSS 16.0作相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 外部形態(tài)變化

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 插穗外部形態(tài)變化Table 1 External morphological changes of cuttings

金邊瑞香插穗扦插8 d后，開(kāi)始發(fā)生形態(tài)變化。扦插后第16天，NAA濃度為600 mg·L-1的處理有30%插穗產(chǎn)生愈傷，愈傷發(fā)生率高于其他各處理，且有3%皮層開(kāi)裂；第32天，600 mg·L-1的處理插穗愈傷發(fā)生率最高達(dá)92%，且沒(méi)有變褐或腐爛發(fā)生，該濃度處理不同時(shí)期愈傷發(fā)生率最高增長(zhǎng)率達(dá)57%。從表1可知，金邊瑞香插穗生根過(guò)程伴隨皮層開(kāi)裂，生根率與皮層開(kāi)裂成正相關(guān)。扦插后第32～40天，愈傷組織產(chǎn)生率變化不大，插穗腐爛和變褐的頻率增大。CK變褐和腐爛程度最大，分別可達(dá)80%和48.3%；其次是800 mg·L-1處理，變褐和腐爛的程度為23%和10%；處理600 mg·L-1，則無(wú)插穗變褐或者腐爛現(xiàn)象發(fā)生。因此，適宜濃度的NAA能夠抑制金邊瑞香插穗變褐和腐爛[11]，有利于愈傷和不定根的發(fā)生[12]。

2.2 生根率的影響

金邊瑞香扦插第40天統(tǒng)計(jì)生根率，結(jié)果見(jiàn)圖1。方差分析見(jiàn)表2。

圖1 NAA處理對(duì)插穗生根率的影響Fig.1 Effect of NAA concentration on the rooting rate of cuttings

由圖1可知，NAA能夠有效促進(jìn)金邊瑞香插穗生根。促根效果好的濃度依次為600＞500＞800＞300 mg·L-1，生根率分別為86.8%、79.2%、58.6%、56.3%，該濃度順序與愈傷發(fā)生率及皮層開(kāi)裂變化趨勢(shì)較一致；CK生根率為0。NAA濃度小于600 mg·L-1時(shí)，隨濃度升高，金邊瑞香插穗生根率呈增加趨勢(shì)，高于600 mg·L-1時(shí)，生根率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與NAA的雙重作用，低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)的結(jié)論相一致。

由表2可知，不同濃度NAA處理金邊瑞香插穗的生根率差異極顯著，說(shuō)明生長(zhǎng)素NAA是一種有效的金邊瑞香生根促進(jìn)劑。進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)表 3），CK、300和 800、500和 600 mg·L-1之間差異顯著，而300和800 mg·L-1或500和600 mg·L-1之間差異不顯著，生根率最好的處理是600 mg·L-1NAA。

表2 不同處理生根率方差分析Table 2 Analysis of variance on the rooting rate of different treatments

表3 不同處理生根率多重比較Table 3 Multiple comparison of rooting rate of different treatments

2.3 不同濃度處理插穗后POD含量變化

POD是一類含鐵卟啉輔基的酶，普遍存在于植物體內(nèi)，其同工酶在植物內(nèi)存在發(fā)育階段特異性和組織特異性，是一種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)酶和生根關(guān)聯(lián)酶[13-14]。由圖2可知，NAA不同濃度處理金邊瑞香插穗生根過(guò)程中，POD活性呈“升高-下降-升高”的趨勢(shì)，并在第24天達(dá)到最高峰值，此時(shí)正是插穗愈傷發(fā)生率和皮層開(kāi)裂增加最高期，POD活性不斷升高，促進(jìn)了根原基的誘導(dǎo)，高活性的POD能氧化IAA，有效降低內(nèi)源IAA濃度，符合低濃度IAA誘導(dǎo)根原基形成的觀點(diǎn)[15]。插穗處理后POD活性最高峰值比開(kāi)始時(shí)增加了 344.5 μg·g-1FW·min-1。不同濃度NAA處理POD活性的峰值均較CK提早了8 d左右，但處理的POD活性較同一時(shí)間內(nèi)CK的值要低，峰值也均沒(méi)有CK的高，最高峰值差為174.6 μg·g-1FW·min-1，最后下降的幅度也比較大。根對(duì)生長(zhǎng)素敏感性最適濃度是10-10mol·L-1左右[16]，CK不生根可能與過(guò)高活性的POD氧化過(guò)多內(nèi)源IAA，造成IAA含量過(guò)低有關(guān)。

圖2 NAA處理對(duì)POD活性變化的影響Fig.2 Effect of NAA treatment on changes of POD activity

2.4 不同濃度處理插穗后可溶性蛋白含量變化結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 NAA處理對(duì)可溶性蛋白含量變化的影響Fig.3 Effect of NAA treatment on changes of soluble proteins content

可溶性蛋白雖只占蛋白質(zhì)的一部分，但是生物體能吸收利用的主要是可溶性蛋白，它在生命體活動(dòng)中發(fā)揮著運(yùn)輸協(xié)調(diào)、免疫保護(hù)、產(chǎn)生和傳導(dǎo)神經(jīng)活動(dòng)、控制生長(zhǎng)分化等功能。圖3表明，NAA不同濃度處理金邊瑞香插穗生根過(guò)程中，可溶性蛋白含量總體呈“下降-升高”趨勢(shì)，各處理下降的速度較對(duì)照要快；最低峰值出現(xiàn)在第24天，600 mg·L-1處理峰值最低，為20.0 mg·g-1FW，較起始時(shí)降低了67.7%，表明在根原基誘導(dǎo)過(guò)程中，插穗原有的可溶性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄缘鞍祝拷档停黄浯螢?00 mg·L-1時(shí)，下降了39.2 mg·g-1FW；最后表現(xiàn)為含量升高趨勢(shì)，可見(jiàn)可溶性蛋白重新合成并在插穗中積累，在不定根的伸長(zhǎng)中起著重要作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 金邊瑞香插條生根及形態(tài)變化

本世紀(jì)初Went對(duì)向光性的研究有了很大進(jìn)展，化學(xué)分離出達(dá)爾文稱為“某種傳導(dǎo)刺激”的物質(zhì)，證明這種物質(zhì)為IAA，同時(shí)將類似物質(zhì)統(tǒng)稱為生長(zhǎng)素[16]。大量試驗(yàn)證實(shí)生長(zhǎng)素對(duì)根原基的發(fā)生起著重要作用[17]。生長(zhǎng)素的作用機(jī)理，基因表達(dá)學(xué)說(shuō)認(rèn)為生長(zhǎng)素可以使細(xì)胞伸長(zhǎng)所需的一些基因擺脫遏制而得到表達(dá)；酸生長(zhǎng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為生長(zhǎng)素與質(zhì)膜上的受體結(jié)合，引起H+向細(xì)胞外運(yùn)輸，引起細(xì)胞壁的酸化和松動(dòng)，在細(xì)胞的膨壓下伸長(zhǎng)。國(guó)外研究人員發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素加強(qiáng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向質(zhì)膜的流動(dòng)，胚芽鞘切段的伸長(zhǎng)速度與H+-ATPase水平的變化一致，支持了酸生長(zhǎng)學(xué)說(shuō)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在供試范圍內(nèi)，NAA促進(jìn)金邊瑞香扦插生根效果的濃度依次是600＞500＞800＞300 mg·L-1，CK處理沒(méi)有生根。方差分析結(jié)果顯示，各處理間生根率差異顯著，且表現(xiàn)出雙重作用，符合生長(zhǎng)素作用的相關(guān)理論。處理后的插條變褐或腐爛的幾率低于CK，說(shuō)明NAA能夠抑制金邊瑞香插穗變褐和腐爛，支持了生長(zhǎng)素作用是間接表達(dá)的理論。本研究還發(fā)現(xiàn)，金邊瑞香插條生根率的高低和插條基部皮層開(kāi)裂的比率呈正相關(guān)，說(shuō)明NAA能夠促進(jìn)基部細(xì)胞分裂速度，從而引起皮層開(kāi)裂。

3.2 金邊瑞香插條POD活性的變化

POD不僅在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中起重要作用，而且對(duì)植物的器官形態(tài)建成也起著非常重要的作用[7]。有研究表明，毛白楊插穗經(jīng)過(guò)NAA處理扦插1 d后，過(guò)氧化物酶的同工酶活性加強(qiáng)，誘導(dǎo)了RNA合成，而后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)形成皮層分生細(xì)胞，最后形成根原基。黃卓烈等研究桉樹(shù)插條POD活性呈規(guī)律性變化，并將POD活性的高低定位判斷桉樹(shù)生根難易的指標(biāo)之一[18]。

金邊瑞香生根過(guò)程中，POD活性呈“升高-下降-升高”的趨勢(shì)，這與前人研究結(jié)果一致[7,19]。Galston等認(rèn)為前期POD活性升高與抑制傷呼吸有關(guān)系[20]；Demetrios等推測(cè)認(rèn)為隨后的升高與根原基形成有關(guān)[21]。本研究中扦插開(kāi)始時(shí)POD活性上升，第24天達(dá)到峰值或最高，與愈傷組織出現(xiàn)高峰相一致。NAA處理插穗POD峰值較CK提前了8 d左右，這個(gè)結(jié)果與前人結(jié)果較相似[7,22-23]，本試驗(yàn)測(cè)定處理POD活性值較CK低，這可能與樹(shù)種和生長(zhǎng)素種類有關(guān)。在逆境中產(chǎn)生的可經(jīng)SOD歧化為O2與 H2O2，再由 POD將 H2O2分解為 H2O和 O2，從而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)免受活性氧的傷害。因此前期POD活性增加，對(duì)抑制金邊瑞香插穗變褐和腐爛具有重要作用；后期POD活性下降，表現(xiàn)出變褐和腐爛的增加，推測(cè)與活性氧的傷害有一定關(guān)系。

3.3 金邊瑞香可溶性蛋白的變化

大量研究發(fā)現(xiàn)，生根過(guò)程中，可溶性蛋白作為誘導(dǎo)物，能夠激活其他與生根有關(guān)的基因活性，因此，可溶性蛋白含量變化與生根有密切關(guān)系[14]。扦插開(kāi)始時(shí)可溶性蛋白含量降低與切口呼吸代謝旺盛有關(guān)[7]。NAA處理，激活了插穗細(xì)胞內(nèi)生化代謝，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，增加了細(xì)胞分裂和分化過(guò)程所需的功能蛋白，促進(jìn)不定根原基的形成，從而促進(jìn)不定根的發(fā)生。本試驗(yàn)中，金邊瑞香插穗基部可溶性蛋白總體呈“下降-升高”趨勢(shì)，前期降低主要與可溶性蛋白轉(zhuǎn)化成功能蛋白誘導(dǎo)根原基的形成有關(guān)，最后表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，與根原基形成后，吸收能力增強(qiáng)，部分可溶性蛋白又重新合成有關(guān)。金邊瑞香插穗可溶性蛋白含量下降的速度要比對(duì)照快，主要是因?yàn)樘幚砩瑢?duì)照沒(méi)有生根，因而功能蛋白形成所消耗的可溶性蛋白也表現(xiàn)出一定的差異。

[1]劉慧．金邊瑞香生物學(xué)特性及其栽培要點(diǎn)[J]．江西園藝,2003(4)∶33-35.

[2]劉文和．ABT生根粉與NAA,IAA,IBA在扦插育苗中的效果比較[J]．江蘇林業(yè)科技,2001,28(1)∶22-24.

[3]柯合作,宋志瑜．金邊瑞香的扦插繁殖與花期管理技術(shù)[J]．福建農(nóng)業(yè)科技,2002(1)∶37-38.

[4]徐成云,陶曉晴．金邊瑞香的扦插繁殖與夏季養(yǎng)護(hù)[J]．安徽林業(yè)科技,1998(4)∶29.

[5]田英翠,楊柳青．金邊瑞香的扦插技術(shù)[J]．林業(yè)實(shí)用技術(shù),2007(1)∶42-43.

[6]魏國(guó)汶,宋小民,黃冬華,等．金邊瑞香的扦插生根研究[J]．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1998,10(3)∶56-59.

[7]潘健．三種柃木屬植物扦插生根機(jī)理研究[D]．江蘇∶南京林業(yè)大學(xué),2007.

[8]曹幫華,扈紅軍,張大鵬,等．桑樹(shù)硬枝扦插生根能力及其生根關(guān)聯(lián)酶活性的研究[J]．蠶業(yè)科學(xué),2008,34(1)∶96-100.

[9]Gaspar T,Kevers C,Hausman J F,et al.Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoots[J].Agronomie,1992(12)∶757-765.

[10]高俊鳳．植物生理學(xué)試驗(yàn)技術(shù)[M]．西安∶世界圖書(shū)出版公司,2000∶192-193.

[11]畢兆東,孫淑萍．基質(zhì)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)食用仙人掌扦插繁殖的影響[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(3)∶368-362.

[12]孫婷婷,胡寶忠,陳玉霞,等．黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)嫩枝扦插生根過(guò)程的解剖學(xué)研究[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(7)∶53-56.

[13]Moneousin C H,GasPar T.Peroxidase as a marker for rooting improvement in Cynara seolymus L.cultivated in vitro[J].Bioehem Physiol Pflanzen,1983,178∶263-271.

[14]Nordstrom A C,Jacobs F A,Eliasson L.Effect of exogenous indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid on internal levels of the respective auxins and their conjugation with aspartic acid during adventitious root formation in pea cuttings[J].Plant Physiol,1991,96∶856-861.

[15]宋金耀,何文林,李松波,等.毛白楊嵌合體扦插生根相關(guān)理化特性分析[J].林業(yè)科學(xué),2001,37(5)∶64-67.

[16]余叔文,湯章城．植物生理與分子生物學(xué)[M]．2版.北京∶科學(xué)出版社,1998∶421-437.

[17]韓碧文,邵莉嵋,陳虎保．植物生長(zhǎng)物質(zhì)[M]．北京∶科學(xué)出版社,1987．

[18]黃卓烈,李明,詹福建,等．不同生長(zhǎng)素處理對(duì)桉樹(shù)無(wú)性系插條氧化酶活性影響的比較研究[J]．林業(yè)科學(xué),2002,38(4)∶46-52.

[19]李明,譚紹滿．難易生根的桉樹(shù)對(duì)過(guò)氧化物酶活性及其同工酶多型性比較研究[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(3)∶56-59.

[20]Galston A W,Davies J P.Hormonal regulation in higher plants[J].Seience,1969,163∶1288-1297.

[21]Demetrios J M,Thomas D S,Traianos Y,et al.Peroxidases during adventitious rooting in cuttings of Arbutus unedo and Taxus baccata as affected by plant genotype and growth regulator treatment[J].Plant Growth Regutlation,2004,44∶257-266.

[22]宋金耀,何文林,李松波,等.毛白楊嵌合體扦插生根相關(guān)理化特性分析[J]．林業(yè)科學(xué),2001,37(5)∶64-67.

[23]Chao I L,Cho C L,Chen L M,et al.Effect of indole-3-butyrie acid on the endogenous indole-3-acetic acid and lignin contents in soybean hypocotyol during adventitious root formation[J].Journal of Plant Physiology,2001,158(10)∶1257-1262.