Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

高勝利 高淑紅 侯澤

Wnt信號通路對許多物種的胚胎心肌分化具有重要作用[1]。對Wnt8a在胚胎心肌細胞分化過程中的作用，存在兩種相反的觀點。一種觀點是Wnt8a抑制胚胎心肌分化[2]；另一種觀點是Wnt8a促進胚胎心肌分化[3]。小鼠胚胎干細胞(ES細胞)在二甲基亞砜誘導(DMSO)下分化成心肌細胞，體外心肌細胞分化與體內完整胚胎心肌發育過程相符，鑒于此，本文以DMSO作為誘導劑，誘導ES細胞心肌分化，檢測分化過程中Wnt8a的表達和作用，研究其在胚胎心肌分化中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ES細胞來源

來自于129純系小鼠胚胎干細胞系(ES-D3)，25～30代。

1.1.2 主要試劑

DMEM高糖培養基，胎牛血清，二甲基亞砜，Frizzled-8/Fc Chimera，RNA提取試劑盒。引物設計見表1。

表1 引物設計

1.1.3 主要儀器

醫用凈化工作臺，CO2培養箱，倒置顯微鏡，凝膠成像系統，PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 ES細胞的復蘇培養

ES細胞復蘇后，接種于小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層上。將已培養2～3天生長旺盛的細胞克隆，消化成單細胞懸液，以1：3～1：6傳代，培養基顏色變黃時半量換液。

1.2.2 實驗分組

實驗組：ES細胞基礎培養基加1%DMSO；對照組：ES細胞基礎培養基加1%DMSO和Frizzled-8/Fc(200ng/ml)。

1.2.3 細胞分化培養

將ES細胞消化吹打成單細胞懸液，轉入培養皿懸浮培養4天形成擬胚體，吸取擬胚體，轉入培養皿中(做PCR)和36孔培養板中，每孔一個擬胚體，加入分化培養基。觀察分化細胞形態及是否出現自發性收縮，對比分化率。

1.2.4 Wnt8a mRNA檢測

從貼壁培養第1天起，每日提取總RNA，RT-PCR檢測分化過程中Wnt8a mRNA的表達。

1.3 統計學處理

應用SPSS統計軟件包11.5對數據進行處理。數據均用(±s)表示，采用student t檢驗。

2 結果

表2 不同誘導劑對胚胎干細胞分化為心肌細胞的影響

圖1 分化第2，3，4天Wnt8a(400bp)的表達

2.1 ES細胞分化為心肌樣細胞

ES細胞貼壁培養第2天起，兩組均可見自發節律性收縮的心肌樣細胞，收縮頻率45～75次/分，持續10天。實驗組分化率為92.22%，對照組分化率為37.78%，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 Wnt8a在分化過程中的表達

兩組在分化第2、3、4天檢測到Wnt8a表達，第5天后未檢測到表達。

3 討論

研究表明Wnt8a抑制胚胎心肌發育，Wnt8a在蛙類、雞、小鼠胚胎中臨近心前區的組織中分泌，心肌的形成取決于Wnt3a和Wnt8a的抑制。將Wnt8 cDNA注射到雞胚4細胞期的2背分裂球，并培養至23或30期，抑制心肌特異因子nkx-2.5的表達[2]。也有研究認為Wnt8a促進胚胎心肌發育，用產生Wnt8a病毒感染雞胚的側中胚層，心肌特異基因的表達未受到影響，未抑制正常心肌分化[3]。

二甲基亞砜能誘導ES細胞分化成心肌細胞，1%DMSO誘導效應最高，分化率達到96.7%[4]。兩組誘導劑誘導ES細胞，可見自動節律性收縮細胞，分化為心肌樣細胞，分化過程Wnt8a表達陽性。對照組加入了Frizzled-8/Fc，Frizzled-8/Fc與Wnt受體Frz結合，競爭性抑制Wnt8a與Frz結合，阻斷Wnt8a作用途徑[5]，盡管對照組Wnt8a表達陽性，但分化率下降，說明了Frizzled-8/Fc抑制了Wnt3a可促進在ES細胞定向分化為心肌細胞的作用。由此推斷，Wnt8a促進小鼠胚胎心肌分化。本實驗還發現，Wnt8a在分化開始第2，3，4天表達，在第5天后未能檢測到，提示Wnt8a對胚胎心肌分化的作用依賴于分化的時期，僅僅在分化早期具有促進作用。隨著研究的不斷深入，對于Wnt信號轉導通路在心肌分化和心臟形成的作用，將有更清晰的認識，有助于了解胚胎心肌分化和心臟發育機制。

[1]Eisenberg LM,Eisenberg CA.Wnt signal transduction and the formation of the myocardium[J].Dev Biol,2006,293:305-315.

[2]Leonard M,Eisenberg.Eisenberg Evaluating the Role of Wnt Signal Transduction in Promoting the Development of the Heart[J].The Scientific World,2007,7:161-176.

[3]Leonard M,Eisenberg.Eisenberg Evaluating the Role of Wnt Signal Transduction in Promoting the Development of the Heart[J].The Scientific World,2007,7:161-176.

[4]王秀麗,虞星炬.二甲基亞砜誘導胚胎干細胞向心肌細胞分化伴隨凋亡現象的研究[J].解剖學雜志,2005,28(06):609-614.

[5]Hsieh JC,Rattner A.Biochemical characterization of Wnt-frizzled interactionsusing a soluble,biologically active vertebrate Wnt protein[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96:3546-3551.