地塞米松對大鼠支氣管哮喘氣道重塑及PDGF-BB表達的影響

張朝薔 薄建萍 李江波

支氣管哮喘是多種細胞和細胞成分參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥和氣道高反應是支氣管哮喘的特點。近年來，氣道重塑在支氣管哮喘發病中的作用受到高度重視，被認為是引起不可逆的氣道阻塞和氣道高反應的病理基礎[1]。PDGF是1974年才發現的一種肽類調節因子，貯存于血小板的α顆粒中，當血小板被激活后，PDGF與血小板因子、β血小板球蛋白等一起釋放出來。體內多種細胞可以產生和分泌PDGF[2]。PDGF-BB為PDGF家族中的主要成員之一，它是由PDGF-B鏈通過二硫鍵而形成的同源二聚物[3]。PDGF-BB具有強烈的促進氣道平滑肌增殖、促進成纖維細胞的增生及膠原蛋白的合成作用，研究發現，氣道上皮損傷后PDGF釋放增多，并能促進共培養體系中肌成纖維細胞增生，因此，PDGF-BB被認為與哮喘過程中氣道平滑肌增生肥厚、氣道痙攣及氣道上皮纖維化有關[4]。本文通過觀察PDGF-BB在不同程度的氣道重塑中的表達變化，探討了PDGFBB與氣道重塑的關系及地塞米松的干預作用。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇SPF級Wistar雄性大鼠40只，2～3月齡,體重160～180g(由山西醫科大學生理動物實驗室提供)。卵白蛋白(ovalbumin,OVA)(由美國sigma公司生產);氫氧化鋁(Aluminum hydroxide,AL(OH)3)(由天津化學試劑三廠生產)；PDGF-BBSP 免疫組化試劑盒(由北京博奧森生物技術有限公司生產)二抗及DAB顯色劑(由北京博奧森生物技術有限公司生產)。彩云JWC-201D型霧化器(由鞍山市同信醫用儀器廠生產)；BH-2型光學顯微鏡(由日本Olympus公司生產)；LY-WN-HP SUPER CCD萬能視頻成像裝置(由成都勵揚精密機電有限公司生產)；BI-2000醫學圖像分析系統(由成都泰盟科技公司提供)。

1.2 制備動物模型 將40只大鼠隨機分為對照組(control group,C組)、模型組(non-intervention group,N組)、早期干預組(early-intervention group,E組)和晚期干預組(late-intervention group,L組)，每組各10只。實驗于第1、8天，E組、L組和N組每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混懸液(內含生理鹽水加卵蛋白100mg,氫氧化鋁干粉100mg)1ml致敏；C組腹腔注射等量的生理鹽水；第15天，E組、L組和N組開始用1%卵白蛋白超聲霧化吸入誘導哮喘發作，1次/d，20min/次,共8周；C組用生理鹽水霧化吸入，1次/d，20min/次,共8周。其中，E組每只大鼠在每次霧化前1h腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；從霧化第15天始，L組每只大鼠在每次霧化前1h腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；C組用生理鹽水代替，注射劑量相同。以出現點頭運動、呼吸急促、腹肌收縮、兩便失禁為哮喘發作標志[5-6]。

1.3 標本制備 每只大鼠在末次霧化后的24h內用25%烏拉坦0.4ml/100g腹腔注射麻醉，開胸取右肺中葉，4%多聚甲醛溶液中固定1周，常規石蠟包埋，切片，分別做HE染色及免疫組化染色。

1.4 圖像分析

1.4.1 HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內氣管面積(AMe)、平滑肌內緣內氣管面積(AMi)。計算公式：支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbm；平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm；衡量氣道重塑程度[7]。

1.4.2 測定PDGF-BB表達區平均光密度值 高倍鏡下，每張免疫組化切片取5個視野，測定每個視野陽性表達區的平均光密度值，取其均值為PDGF-BB的相對含量。

1.5 統計分析 采用SPSS16.0專用統計軟件，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t法，兩個變量間的關系采用線性相關分析，結果以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為有統計學意義。

表1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度(um)

表2 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區的平均光密度值

2 結果

2.1 肺組織病理學改變 光鏡下觀察N組大鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯的增厚，黏膜皺褶增多，黏膜下層增寬，管腔狹窄，有時可見黏液栓堵塞，氣道上皮細胞脫落，黏膜下及管周有大量的炎性細胞浸潤(以嗜酸粒細胞和淋巴細胞為主)。E組較上述的病理變化明顯減輕。L組的病理變化介于N組、E組之間。C組幾乎無上述病理變化。

2.2 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測定(見表1)。

2.3 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達的測定(見表2)。

2.4 統計學分析結果

2.4.1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度比較 各組大鼠支氣管管壁厚度數據方差分析得F=126.88,P＜0.01；進一步進行LSD-t法，任何兩組間支氣管管壁厚度比較,差異均有統計學意義(P＜0.05)。同樣，各組大鼠支氣管平滑肌厚度數據經方差分析得F=125.47，P＜0.01;進一步進行LSD-t法，任何兩組間支氣管平滑肌厚度比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

2.4.2 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區的平均光密度的比較 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區平均光密度數據由方差分析得F=222.10,P＜0.01;進一步進行LSD-t法，任何兩組間PDGF-BB表達區平均光密度比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。E組低于N組和L組(P＜0.05)；C組低于E組(P＜0.05)；L組低于N組(P＜0.05)。

2.4.3 各組大鼠PDGF-BB與支氣管管壁厚度及平滑肌厚度之間的關聯性分析 繪散點圖知，PDGF-BB濃度與支氣管管壁厚度呈線性趨勢,Pearson相關系數r=0.96(t=9.70,P＜0.001)，表明肺組織中的PDGF-BB濃度與支氣管管壁厚度間呈線性正相關；同樣，繪散點圖知，肺組織中PDGF-BB濃度與平滑肌厚度也呈線性趨勢，Pearson相關系數r=0.98(t=13.92,P＜0.001)，表明肺組織中的PDGF-BB濃度與平滑肌厚度間也呈線性正相關。

3 討論

氣道重塑指發生在大小氣道的結構改變，在支氣管哮喘中氣道結構的改變包括上皮下纖維化，平滑肌增生，腺體增生肥大，新生毛細血管形成和上皮改變。氣道改變導致了氣道壁增厚從而使得氣道變窄，氣道高反應，氣道壁水腫和黏液分泌增多，被認為是難治性哮喘的重要病理基礎。在這些病理過程中，氣道平滑肌增生是哮喘氣道重塑的一個主要特點[1]。有研究表明，PDGF-BB在肺組織中表達增多，被認為可能與氣道重塑和氣道平滑肌增生有關。研究還表明PDGF-BB是經STAT通路誘導平滑肌增生[8]。從本實驗結果中，我們看到早期干預組、晚期干預組和模型組中氣道重塑的程度逐漸加重，而PDGF-BB濃度隨著氣道重塑程度的加重也呈上升趨勢，兩者關聯分析發現存在線性正相關，由此可見，PDGF-BB與支氣管哮喘氣道重塑有著密切的關系。哮喘治療的首選藥物為糖皮質激素[9]。在本實驗中，應用地塞米松干預后，早期干預組氣道重塑程度較模型組明顯減輕，而晚期干預組介于兩者之間，其可能是通過下調了PDGF-BB而起作用，也表明早期使用糖皮質激素可以延緩氣道重塑的過程，但不能逆轉。該實驗提示，臨床哮喘患者應早期診斷和早期使用糖皮質激素。另外，使用PDGF-BB拮抗劑可能延緩氣道重塑，但這一觀點尚需進一步大量的臨床實驗研究來證實。

[1]Ce line Bergeron1,Wisam Al-Ramli,Qutayba Hamid.Remodeling in Asthma[J].Proc Am Thorac Soc,2009,6:301-305.

[2]彭海兵,王獻華.PDGF調節因子及其信號轉導通路與肺纖維化[J].Modern Preventive Medicine,2008,35:24.

[3]Linda Fredriksson,Hong Li,Ulf Eriksson.The PDGF family:four gene products form five dimeric isoforms[J].Cytokine & Growth Factor Reviews,2004,15:197-204.

[4]鐘南山.支氣管哮喘[M].北京:人民衛生出版社,2006:8.

[5]Salmon M，Walsh DA,Koto H,et al.Repeated allergen exposure of sensitized Brown Norway rats induces airway cel I DNA synthesis and remodeling[J].Eur R,espir J,1999,14(3)：633-641.

[6]Palmans E,Kips JC,Pauwels R A.Prolonged AIlergen Exposure Induces Structural Airway Changes in Sensitized rats[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2):627-635.

[7]王傳夏,李昌崇,羅運春,等.支氣管哮喘大鼠氣道重塑中肺泡巨噬細胞的作用[J].中華結核和呼吸雜志,2006,29(11):740-743.

[8]Marina C.Simeone-Penney,Mariano Severgnini,Lilliana Rozo,et al.PDGF-induced human airway smooth muscle cell proliferation requires STAT3 and the small GTPase Rac1[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2008,294:698-704.

[9]Sum Yee Leung,MD,Paul Eynott,et al.Effects of ciclesonide and fluticasone propionate on allergen-induced airwayinflammation and remodeling features[J].Allergy Clin Immunol,2005,115:989-996.