白背毛木耳雜交育種及雜交子選育*

冀 宏，劉 萍，朱 清，姚璐曄，徐 兵

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

白背毛木耳 （Auricularia polytricha）隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬中的毛木耳種[1]。毛木耳為著名的食藥兼用真菌，質脆滑爽，被譽為 “樹上海蜇皮”，目前國內和東南亞市場需求與日俱增。國內白背毛木耳栽培技術和品種均源自臺灣省，由于種質單一，經過多年的生產，菌種呈現性狀退化趨勢，加快選育優良性狀新品種是相關技術研究所關注的主要方向[2，3]。對異宗結合食用菌來說，目前育種研究應用普遍，同時也最具成效的方法是雜交育種技術，經過有性繁育培養的菌種，則有可能在各方面表現出優于親本的良好性狀[4－7]。該技術的關鍵是有性單孢子收集和雜交子鑒定。白背毛木耳是異宗結合的四極性菌類，每個擔子上通常有4個擔孢子[1]，通過試驗可以獲得毛木耳有性單孢子[8]。同工酶分析作為化學分類的重要指標應用于真菌的分類鑒定中，是菌株分類鑒定和親緣關系研究的重要手段。酯酶是一種食用菌中存在較普遍的酶，其同工酶譜又具有較高的多型性，因而特別適于作為雜種鑒定的指標[9]。采用酯酶同工酶分析鑒定毛木耳雜交子是最為真實可靠的方法。

白背毛木耳生產已成為江蘇省豐縣農業經濟的特色產業。由于生產模式粗放，近年來菌種退化嚴重。本研究旨在通過單孢子收集、菌絲體融合、酯酶同工酶分析的雜交育種方法，對產區主打生產品種 “豐2”進行優化改良，獲得更加適合當地資源環境條件的性狀優良的雜交子，為白背毛木耳區劃良種選育提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試品種

江蘇豐縣師寨鎮白背毛木耳產區主流品種 “豐2”。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、牛肉膏、維生素B1、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、過硫酸銨、蔗糖、Tris、TEMED、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固蘭RR鹽、丙酮、乙酸、溴酚藍，上述試劑均為分析純，由中國醫藥集團上海化學試劑有限公司提供。豆粕、麥麩、玉米粉、馬鈴薯等為市購。

酯酶同工酶電泳的試劑配制參照NY－T 1097－2006[7]。

1.1.3 培養基

PDA 培養基： 馬鈴 薯 20 g·100－1·mL－1、 葡萄 糖 2 g·100－1·mL－1、 瓊脂 2 g·100－1·mL－1， pH 自然液體培養基：馬鈴薯 20 g·100－1·mL－1、 玉米粉 3 g·100－1·mL－1、 葡萄糖 2 g·100－1·mL－1、 蛋白胨 0.2 g·100－1·mL－1、 磷酸二氫鉀 0.2 g·100－1·mL－1、 硫酸鎂 0.1 g·100－1·mL－1、 維生素 B1（10 mg·100－1·mL－1）、 酵母粉 0.5 g·100－1·mL－1， pH 自然

栽培培養基 （木屑麥麩培養基）：木屑73%、麥麩25%、糖1%、碳酸鈣1%，含水量65%。

1.2 儀器與設備

EL104電子天平，梅特勒－托利多上海儀器有限公司；S－SW－CJ－2F超凈工作臺，上海博泰實驗設備有限公司；HYG－A全溫搖瓶柜，太倉市博萊特儀器廠；303型智能人工氣候培養箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；光學顯微鏡，江南光電股份有限公司；3K30高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；1000μL移液槍，英國吉爾森公司；DYCZ－24DN型垂直板電泳槽，北京六一儀器公司；顯微鏡圖像分析系統，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子收集

采用鉤懸法收集單孢子。方法如下：無菌操作將耳片用無菌水洗滌，無菌紗布吸干，切成大小合適 （以不碰觸三角瓶口、壁為宜）的塊狀，取滅菌回形針，一端鉤住耳片，另一端鉤在三角瓶口上 （瓶內事先注入厚1 cm滅菌PDA培養基），加中性硅膠塞封口，試驗設置若干組，置26℃培養，取出瓶內耳片后，繼續培養，觀察瓶底部培養基孢子萌發情況。

將孢子萌發形成的單菌落挑至斜面培養基中編號培養，待菌絲滿管，于4℃條件下保藏。

1.3.2 單核菌絲篩選

無菌操作挑取上述培養菌絲體制成水封片，置于高倍顯微鏡下觀察，無鎖狀聯合且菌絲細弱者即為單核菌絲，確認后標記為雜交親本。

1.3.3 雜交組合設計

實驗采用單核菌絲雜交育種進行種內雜交 （兩點法）。在同一平板培養基 （直徑90 mm）上相距1.5 cm，分別接種不同單孢子萌發的單核菌絲，26℃恒溫培養。

1.3.4 雜交子鑒別

1）鏡檢鎖狀聯合

挑取雜交組合相交部位的菌絲，制成水封片，置于40×10倍顯微鏡下觀察鎖狀聯合結構。

2）拮抗實驗

采用三點法在平板培養基中分別接入親本和雜交子，26℃培養觀察并記錄實驗結果。

3）酯酶同工酶電泳法鑒定雜交子

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10－12]。

（1）樣品制備

菌絲體培養：采用1.1.3中的液體培養基，無菌條件下接種試管斜面菌絲體，靜置24 h后置于搖床中，溫度26℃， 220 r·min－1條件培養， 培養時間為 5 d。

收集菌絲球，40℃烘干。分別稱取0.5 g菌絲球、0.5 g石英砂，將樣品提取液1 mL放于研缽中冰浴研磨，4℃，10000 r·min－1離心10 min，取上清液，將上清液、蔗糖、溴酚藍按 （體積比）5∶1∶1混合制成樣品液 （研磨離心后的樣品須當天使用）。

（2）凝膠制備

分離膠：將分離膠緩沖液、分離膠貯液、蒸餾水、過硫酸銨，按體積比1∶2∶2∶4比例混合均勻，用移液槍加入電泳槽中至距短板上沿3 cm處，并封上適量蒸餾水，使分離膠液面平行。待膠聚合后用吸水紙小心將水分吸盡。

濃縮膠：將濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、核黃素溶液、蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的體積比混合均勻，灌入膠室，立即插好樣品梳，日光燈下聚合。

（3）點樣

濃縮膠聚合后緩慢去除樣品梳，吸去點樣孔中多余水分，上槽、下槽加好電極緩沖液后，用50μL微量進樣器吸取樣品20μL插入樣品槽底部，緩慢注入。

（4）電泳

將電泳槽和電泳儀相連，打開電源，平放于冰箱內，連接電源，上槽為負極，下槽為正極。電泳在4℃冰箱中進行。指示劑在濃縮膠位時，電壓180 V，待指示劑進入分離膠后，電壓增至210 V，電泳采用穩定檔。當指示劑遷移至距膠板下緣2 cm左右時停止電泳。

（5）染色及固定

電泳完畢將凝膠立即轉移至染液中，直至出現褐色條帶，蒸餾水沖洗數次，置于固定液中固定。

（6） 結果計算

置于凝膠成像系統 （76S/07969，Biorad）下拍照，計算遷移率 （Rf） 和相似系數 （Se）。

實驗以 “豐2”親本雙核菌絲與雜交子菌絲進行酯酶同工酶譜分析對照，以鑒定雜交子真實性。

1.3.5 雜交子出耳試驗

雜交子出耳試驗在人工氣候箱內進行，以親本 “豐2”為對照，觀測雜交子結實能力及生產性狀。

2 結果與分析

2.1 孢子收集及單核菌絲篩選結果

鉤懸法結果顯示，26℃靜置3 d，可見瓶內培養基上形成一個霧狀孢子印。無菌操作把懸掛瓶內的耳片取出，26℃繼續培養，經過3 d～4 d，孢子萌發，在培養基表面就會出現許多淺白色菌落 （圖1）。無菌挑取單孢子菌落（最好挑取瓶壁上的單個菌落）轉接至試管斜面培養基，26℃恒溫培養。

挑取試管斜面菌絲制成水封片，置于顯微鏡下觀測，無鎖狀聯合且生長細弱的菌絲即為單核菌絲 （圖2），保存并作為雜交材料。

2.2 雜交實驗結果

試驗共設置169對單核菌絲×單核菌絲隨機雜交組合。選取部分可親和雜交組 （目測）見表1。

圖1 單孢子萌發形成小菌落

圖2 顯微鏡下的單核菌絲（40×10 倍）

表1 單核菌絲雜交組合可親和組

2.3 雜交子鑒定結果

觀察各雜交試驗組發現，部分菌落相交部出現了明顯的溝狀拮抗，鏡檢此區域菌絲未發現鎖狀聯合，則認為試驗組雜交不親合；而部分組合相交部位微微隆起形成明顯菌絲線 （圖3），鏡檢此區域菌絲發現鎖狀聯合，即認為試驗組雜交親合，對選定的雜交組合進行鎖狀聯合鏡檢和親本拮抗實驗初篩，最后經酯酶同工酶電泳確定雜交子。

2.3.1 鏡檢鎖狀聯合

雜交成功則菌絲為雙核體，鏡檢可觀察到鎖狀聯合，見圖4。

圖3 單核4與16雜交菌落形態

圖4 雜交組合的鎖狀聯合（箭頭所指 40×10倍）

鏡檢表1各雜交組合菌絲，只有22×4、22×16、4×16雜交組合出現鎖狀聯合，且菌絲強壯，活力旺盛，初步認為是雜交子 （雙核菌絲）。

2.3.2 拮抗實驗結果

雜交株與親本株的拮抗試驗是較為實用的鑒定方法。試驗系統顯示，雜交菌株至少對親本株之一呈明顯的拮抗性，有些則對雙親株均呈現拮抗反應，拮抗表現的多樣性反映著雜交子變異程度的不同[13]。雜交組合鏡檢及親本拮抗試驗結果見表2。

將上述雜交子與親本 “豐2”進行兩點培養，結果顯示雜交組合22×4、4×16與親本出現明顯拮抗線，其余組合與親本拮抗不明顯，初步確認試驗組22×4、4×16為雜交子。在此基礎上，進行酯酶同工酶譜分析，進一步驗證雜交子真實性。

表2 雜交組合鏡檢及親本拮抗試驗結果

2.3.3 酯酶同工酶譜分析結果

酯酶同工酶電泳酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的，所以通過觀察酶帶的條數、位置、寬度和染色深淺，可判斷雜交子與親本的基因組異同[14，15]。下面僅以雜交組合4×16為代表，說明本試驗酯酶同工酶譜分析的方法與結果。

圖 5和圖 6分別為親本 （“豐 2”） 和雜交子 （4×16）酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜及其模式圖。

圖5 親本酯酶同工酶圖譜及模式圖

圖6 雜交子酯酶同工酶圖譜及模式圖

由圖5、圖6可以看出 “豐2”有6條酶帶，雜交組合4×16有7條酶帶，兩者共有的條帶數為5條。 “豐2”特有條帶1條，遷移率為0.885，雜交組合特有條帶2條，遷移率分別為0.318、0.602。由于酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的。所以可以知道這兩個菌株的基因組是不一樣的。同時從圖上也可以看出酶帶的寬度和顏色深淺不同，這表明酶的活性和含量也是不同的[14]。

計算親本與雜交子之間的相似系數Se，以 “豐2”作為標準樣品，計算公式為：

式中：Se表示被檢樣品和標準樣品二者間相似系數；Sxy表示被檢樣品和標準樣品二者間共有酶帶數；Sx表示標準樣品特有酶帶數；Sy表示被檢樣品特有酶帶數。

相似系數表明了兩者之間的親緣關系，從結果可以看出來兩個菌株的遺傳特性是有明顯差別的。因此可以得出這樣的結論，雜交組合4×16是不同于親本 “豐2”的新菌株。

2.4 雜交子出耳試驗結果

為考察雜交子生長、結實、產量等生產性狀，在相同條件下，以親本為對照進行了雜交子料袋出耳試驗。試驗在人工氣候箱中完成。結果表明雜交子不僅具有結實能力，且生長優勢較明顯。雜交子及親本生長活力比較試驗結果見表3。

表3 雜交子及親本生長活力比較試驗結果

表3滿袋時間和菌絲生長速度充分顯示，雜交子4×16生長活力較親本旺盛；然而， “豐2”接種固體培養基后對栽培料適應性較強，萌發最快，說明在生產應用中可以通過培養基優化，進一步提升雜交子生產性能。雜交子4×16、22×4與 “豐2” 出耳試驗結果見圖7、 圖8。

圖7 雜交子4×16與 “豐 2”出耳試驗結果

圖8 雜交子22×4與 “豐 2”出耳試驗結果

圖7、圖8說明，雜交子具有良好的結實性能，且在相同條件下，2組雜交子均表現出現蕾快、耳片生長快的優勢特征；從子實體形態性狀考察，雜交子4×16的耳片舒展、厚實、圓整，較雜交子22×4更優。

綜上結果，雜交子4×16實驗室生產性狀優勢顯著，具備白背毛木耳優良新品種開發潛力。

3 結論與討論

本實驗說明，利用單核菌絲進行白背毛木耳種內雜交育種方法可行。雜交子4×16表現出優于親本的良好生產性狀，經過生產適應性馴化，極可能成為性狀優良的白背毛木耳生產新品種。

進行雜交子鑒定時，要將鏡檢鎖狀聯合、親本拮抗實驗、酯酶同工酶電泳圖譜分析相結合，才具有較高的可信度。

拮抗試驗結果只能作為判定雜交親和性的部分依據。本實驗挑取雜交子時發現，雖然單核菌落間有隆起的生長線 （常規判斷為拮抗線），但取此區域菌絲鏡檢卻分明看到鎖狀聯合，顯示雜交成功。這種情況雖然具有實際應用價值，但尚需探討其理論機制。

在實際操作過程中，酯酶同工酶電泳技術仍存在溫度條件難控制，酶活性不穩定等問題[16]。本實驗中發現，白背毛木耳酯酶同工酶的種類和酶活性與菌絲球的液體培養時間有關，培養時間越長酶譜中酶帶顏色越深 （酶活性越強），因此，電泳條件的控制和一致性是極為重要的。

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