豬瘟病毒研究進展與防控中的幾項實用技術

胡 峰，崔玉東，崔尚金

(1.中國農科院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室豬傳染病學研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江八一農墾大學動物科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

豬瘟（swine fever， hog cholera），我國俗稱爛腸瘟，歐洲為了區別于非洲豬瘟稱其為古典豬瘟（classical swine fever，CSF）。病原是豬瘟病毒（CSFV），屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（estivirus） 。豬瘟被國際畜疫會和歐盟列為須申報的動物傳染病，我國也將其列為一類傳染病。該病于1833年首先發現于美國的俄亥俄州，自1983年開始暴發的百余年來，己經遍布全世界，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。1997年在荷蘭暴發了CSF，1993年到2000年在德國暴發，比利時和意大利20世紀90年代也相繼暴發CSF。盡管世界各養豬大國對CSFV給予了足夠的重視，但是由于參差不齊的疫苗質量，不合理的引種、免疫程序以及野豬群也攜帶豬瘟病毒等因素，致使CSF目前仍是威脅各國養豬業的一個極重要的傳染病，因此長期以來，豬瘟一直是獸醫疫病研究的重點和熱點之一。

1 診斷方法

近年來，豬瘟的流行和發病特點發生了很大變化，CSF的發病早期不表現出所有的癥狀，而且表現的癥狀也越來越不明顯，沒有單一的癥狀能確診CSF。被CSFV感染的豬發燒出現的敗血癥與沙門氏菌、放線桿菌、嗜血桿菌等引起的敗血癥狀和病變相似，所以也不容易區分。CSFV與牛病毒性腹瀉病病毒（BVDV）同屬于瘟病毒屬，在結構上、遺傳性以及抗原性上密切相關，所以與CSFV存在血清學交叉反應，對豬瘟的診斷造成了干擾。此外，豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的大規模應用，也給CSFV野毒感染豬和疫苗感染豬的血清學鑒別診斷帶來較大困難，歐盟已經禁止使用傳統弱毒疫苗。目前感染CSFV的活豬主要通過對全血中的病毒或病毒核酸以及血清中抗體的檢測進行診斷，對感染了CSFV的病死豬主要檢測器官中的病毒、病毒核酸以及抗原進行診斷。

1.1 病原學檢測

1.1.1 病毒分離與鑒定

取病變組織（扁桃體、脾臟、淋巴結等）研磨成乳液，離心、過濾后，接種于PK-15細胞上培養，其他細胞系也可以用于病毒分離，但它們至少和PK-15對CSFV有相同的敏感性。培養24～72 h后可以用免疫熒光抗體試驗（FAT）進行檢測，也可以在4～5 d后固定，用免疫過氧化物酶染色法檢測。該方法的敏感性比冷凍切片免疫熒光試驗的敏感性高，但是速度慢，花費較長時間。

肝素或EDTA處理豬的全血可以用于CSF的早期診斷，該方法比利用血細胞的某些成分進行CSF的早期診斷敏感性高，操作簡便。在－20 ℃條件下冷凍全血樣本，并在37 ℃條件下水浴融化。將血細胞溶解的血液接種到單層生長的PK-15細胞上，37 ℃孵育1 h。接種后3～4 d，用PBS洗板，固定，染色，最后用過氧化物酶中和試驗檢測。該方法的缺點是在診斷急性CSF時的敏感性低于傳統的病毒分離方法。

1.1.2 豬瘟兔體免疫交互試驗

豬瘟強毒不引起家兔體溫反應，但能使其產生免疫力，豬瘟兔化弱毒（HCLV）能使家兔產生定型熱反應，但對已產生免疫力的家兔則不產生體溫反應。將病料乳劑接種健康家兔，7 d后用兔化豬瘟弱毒注射家兔，24 h后每6 h測溫1次，連續3 d。無定型熱反應，說明病料中含有豬瘟病毒。

1.1.3 免疫熒光抗體試驗（FAT）

FAT是一種快速檢測存在于扁桃體、脾臟、腎臟、淋巴結或回腸遠側部CSFV抗原的方法。各種組織器官需要來自不同的患病豬，并且在低溫運輸過程中不能使用一些防腐劑。將冷凍切片直接用連有異硫氰酸熒光素（FITC）的抗CSF免疫球蛋白染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。在感染初期扁桃體最先受到影響，所以扁桃體最適合用此方法檢測。患有亞急性和慢性CSF的病豬，FAT檢測回腸常顯陽性，有時是唯一顯示熒光的部分。這種方法敏感性高、可靠。但是FAT方法對實驗操作人員的操作技能和熒光分析等要求很高，否則會出現較高的錯誤率，通過FAT檢測為陰性的不能完全排除沒有受到CSFV的感染。FAT中使用的抗CSF的免疫球蛋白不能將瘟病毒屬中不同種的抗原區分開。用于FAT的連接物必須是由來自無特定病原體豬的抗CSFV γ-球蛋白制備的。該方法只能用于新近死亡的動物，因為自我溶解和細菌污染都會造成熒光顯色時背景著色較深，不易觀察。

1.1.4 雞新城疫病毒強化試驗（END）

豬瘟病毒與NDV在豬睪丸細胞上均不產生細胞病變（CPE）。在一定條件下，先被CSFV感染的豬睪丸細胞，隨后再感染NDV時可產生CPE。這一現象稱為新城疫病毒強化試驗（END）。具體方法是在豬睪丸細胞培養物中接種無菌處理的被檢材料，傳代適應之后再接種NDV，繼續培養3 d，如果細胞出現病變，則表示有CSFV存在。Hao Xu等利用這一現象對CSFV的NS3蛋白進行了研究，表明NS3能誘導細胞凋亡。

1.2 血清學檢測

血清學檢測通常用于了解豬的群體免疫水平和對疫苗免疫效果進行評價，為預防接種提供科學依據。檢測CSFV的抗體，在提前預測感染了低毒力CSFV的疑似豬中非常有用。因為CSFV具有免疫抑制作用，所以感染后21 d才能確切地檢測到抗體。血清學調查的目的就是檢測CSF的殘留，特別是種畜群，同時還用于CSF撲滅的最后階段的檢測。利用單克隆抗體的病毒中和試驗（VN）和ELISA能滿足敏感度的要求。氧化物酶聯中和試驗（NPLA）和免疫抗體中和試驗（FAVN）是應用最廣泛的技術， 2個試驗都可在微量滴定板上進行。

1.2.1 正向間接血凝試驗（IHA）

抗原與相應的抗體在一定條件下結合形成抗原抗體復合物，但一般肉眼看不見這種復合物。若將抗原吸附（致敏）在經過特殊處理的紅細胞表面，就能大大提高抗原抗體反應的靈敏性。毛文杰等將待檢血清經56 ℃ 30 min滅活，在96孔血凝板上將待檢血清、陽性血清和陰性血清用稀釋液作倍比稀釋，各稀釋12孔，隨后加入減半量的豬瘟間接血凝抗原，輕搖振蕩均勻，室溫放置2 h后觀察結果，來檢測豬的群體免疫水平，該方法操作簡單、重復性好。

1.2.2 中和試驗

中和試驗原理是病毒或毒素與相應的抗體結合后，失去對易感動物的致病力。

熒光抗體病毒中和試驗（VN）。將待檢血清56 ℃ 30 min滅活后做適當稀釋，與等體積的200 TCID50/0.1 mL的CSFV中和，然后接入PK-15細胞，維持液孵育2 d以上。采用直接免疫熒光方法進行檢查，并設立對照組。可發現對照組有翠綠色光斑，而試驗組光斑消失。其優點特異性強，操作簡便，但不能定量。

過氧化物酶聯中和試驗（NPLA）。將待檢血清稀釋后與200 TCID50/50 μL的病毒液中和，然后接入細胞，待細胞長成單層后固定，加入高免豬抗CSFV血清，最后加入辣根過氧化物酶（HRPO）標記的抗豬IgG，作用后加入底物顯色，根據顏色就可判定結果。

表面等離子體共振（SPR）試驗。基于表面等離子體共振技術的蛋白芯片可用于檢測抗體滴度，Gomes,P等人利用SPR試驗對14個農場的170份血清樣品進行檢測，結果表明SPR試驗具有較高的特異性和敏感度，并且沒有交叉反應，與ELISA相比該方法是一種用于CSFV感染后的血清學診斷和免疫后抗體低度檢測的快速的（總共需要1.5 h）有價值的工具。目前已經利用SPR試驗直接對口蹄疫病毒、疫苗病毒、脊髓灰質炎病毒、煙草花葉病毒進行檢測。

1.2.3 ELISA試驗

1.2.3.1 捕獲ELISA方法

為了快速診斷CSF，抗原捕捉ELISAs試驗可用于新近疑似感染CSFV的畜群的篩選，ELISAs是一種雙抗體夾層式，利用單克隆抗體或多克隆抗體檢測血清中的病毒蛋白、血細胞以及血液中的抗凝因子。另外，某些試劑盒還用于純化組織均質物。此項技術操作起來相對簡單，不需要組織培養設備，便于自動化，只需半天就可出結果。但缺點是靈敏性比病毒分離方法的低，特別是對溫和型和臨床癥狀不明顯的病例檢測中靈敏性較低。這一缺點可以通過對所有的疑似發熱畜群進行檢測來得到補償，然而在檢測中還應考慮試驗的特異性。該方法不適合單個患CSF的病例診斷。捕獲ELISA能夠檢測2種不同豬瘟病毒株感染的病豬的血液和組織中的抗體。

1.2.3.2 間接ELISA法

首先包被抗原，將待檢血清稀釋后加入孔中，然后加入標記物，最后加入底物顯色，酶標儀讀數判定結果。Guo-zhen LIN等人利用大腸桿菌表達CSFV的E2中4個抗原表位，并作為包被抗原建立間接ELISA，特異性地檢測豬血清樣品中的抗CSFV抗體。結果表明，與間接血凝試驗（IHA）相比，間接ELISA方法的敏感度是97.5%，特異性是96.7%。包被的抗原與抗牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗體之間無交叉反應。

1.2.4 單克隆抗體技術

用純化的豬瘟病毒免疫BALB/ c小鼠，取其脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合。經篩選最終獲得了能穩定傳代并分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備的單克隆抗體與其他抗原無交叉反應，能快速做出診斷。用過氧化物酶或異硫氰酸熒光素連接物標記的3種單克隆抗體，分別特定性的檢測CSFV野毒株、CSFV疫苗株和反芻動物瘟病毒，一方面能準確的將CSFV野毒株與CSFV疫苗株區分開，另一方面能將CSFV與其他瘟病毒區分開。豬感染了CSFV后體內會產生針對結構蛋白Erns和E2以及非結構蛋白NS3的抗體，通過針對NS3的單克隆抗體表明NS3是保守的抗原表位，因此可以利用針對Erns和E2的單抗來區分豬瘟病毒屬的不同種和同一種中的不同株。

1.3 分子生物學方法

1.3.1 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

通過純化感染了CSFV的PK-15細胞培養液，提取CSFV，設計引物，利用RT-PCR擴增5'端的非編碼區和編碼糖蛋白E2基因的目的片段，測序，并與數據庫的序列進行比較，從而做出診斷。該方法是國際上認可的用于快速診斷CSF，它的靈敏度高于抗原捕捉ELISAs和病毒分離方法，所以它較適合于臨床診斷。因其診斷的速度和敏感性現在已被歐盟一些國家所接受。但是該方法在操作時要防止實驗室污染，以免造成假陽性，同時待檢樣品中含有抑制劑也會造成假陰性。對初次暴發CSF的地區診斷的陽性結果都須用其他方法進行確診。CSF的分子流行病學基于不同病毒株的遺傳差異，RT-PCR根據核酸序列擴增CSFV的RAN，這是獲得用于比較的核酸序列數據最簡單的方法。

1.3.2 套式PT-PCR

套式PT-PCR是一種基于限制性片段長度多肽性分析而建立起來的診斷方法，用于對CSFV基因亞型的分類和區分CSFV疫苗株和野毒株。Ning Chen等人基于對CSFV蛋白E2基因的限制性片段長度多肽性分析建立了套式PT-PCR，對來自中國東南部2003年到2008年間的321例臨床樣本進行檢測，檢出96例陽性樣本，并對這96例陽性樣本做進一步區分鑒定，鑒定出23例是感染疫苗株CSFV，62例是野毒株，11例是疫苗株CSFV與野毒株混合感染。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術（FQPCR）

實時熒光定量PCR技術（FQPCR）在基因表達水平的分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到了廣泛應用。在熒光實時PT-PCR技術中利用了非特異性的SYBR Green I作為染料和特異性的水解熒光探針Taqman（standard rRT-PCR）。Taqman探針是一條線性的寡核苷酸鏈，熒光染料在其5′端，淬火分子在其3′端，與互補DNA雜交后，在延伸過程中被具有5′-3′外切酶活性的Taq聚合酶降解，同時放出報告基因的熒光。Risatti等應用standard rRT-PCR對CSFV快速檢測進行了研究，試驗結果表明該方法的敏感性可以達到甚至超過病毒培養。目前Guoyuan Wen等人利用小溝結合探針（MGB）建立了MGB實時RT-PCR技術(MGB rRT-PCR)，MGB部位可以使探針更加牢固的結合到單鏈DNA上，因此在反應中可以提高解鏈溫度，從而可以設計更短的特異性強的探針。結果表明，MGB rRTPCR技術的敏感度比standard rRTPCR技術和病毒分離方法高出10倍。檢測261份現場樣品，MGB rRT-PCR技術與standard rRT-PCR技術和病毒分離的檢測結果一致性分別是93.3%和76.7%。Zhao JJ等人建立了多重實時RT-PCR，可定量的區分CSFV野毒株和疫苗株。

1.3.4 環介導等溫擴增技術(LAMP)

LAMP是一種新型的，快速的，敏感性高的診斷技術，由日本的Notomi等人創建。RT-LAMP是在恒溫條件下進行的，不需要額外的加熱設備，只需要一個水槽和熱帶就能完成擴增，只需一個管將所有反應物混合在一起，63 ℃ 1 h。效率高，可以對大量的樣品進行檢測。基于此目前LAMP已廣泛用于病毒診斷。針對CSFV編碼區保守序列設計6條引物（2條外引物，2條內引物，2條環引物），倍比稀釋病毒。靈敏度試驗表明比RT-PCR高100倍，能檢測到10-6稀釋的103.84TCID50的CSFV。LAMP檢測出13株CSFV，同時與其他非CSFV進行交叉反應，結果都是陰性。

1.3.5 PCR-ELISA

PCR-ELISA 是用免疫學方法檢測PCR產物，即在PCR擴增后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。其原理是在進行PCR擴增時一個引物的5′端標記生物素，另一引物則在5′端標記顯色基團（如FITC，用HRP標記的抗FITC結合顯色），這樣PCR產物就可結合到親和素包被的塑料板上，靶序列被捕獲。再在微孔中加入用HRP標記的抗體，抗體與靶序列上的抗原結合，再加入底物使之顯色，可進行常規ELISA檢測，設計已知標準對照，可進行定量。該方法的敏感性可與放射性核素標記相比，但又避免了核素的危險。

1.4 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合。因此膠體金技術廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學等領域。顧建等人用免疫膠體金技術對20份血清進行檢測，同時采用ELISA方法同比檢測作對比，免疫膠體金技術檢出陽性率是75%，ELISA方法檢出率是90%。雖然免疫膠體金技術敏感度低，但具有簡便、快速、并可單份操作的優點，步驟單一，實驗過程時間20 min左右，無須儀器協助，且標本不易污染，適用于緊急檢測。

1.5 基因芯片技術

基因芯片是近年來分子生物學與微電子學等多學科交叉融合而成的一項高新技術，指在一個很小的表面，通常是硅化玻璃，覆蓋有成千上萬的寡核苷酸，每一個固定在芯片上的特定位置，可以找到這個點，每個寡核苷酸反應芯片上成千上萬拷貝互補信息。包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片。楊林采用基因測序為基礎的系統進化樹的分析方法，對黑龍江部分地區豬瘟病毒流行株進行分離鑒定和E2基因序列分析，并與傳統石門強毒和豬瘟兔化弱毒苗在抗原基因上存在的變異進行了比較，結果表明：所檢測的病料是CSFV感染、CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定差異，E2基因部分序列接近CSFV的Alfort株，與Brescia同源性最低。姜永厚等人究建立了一種基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片檢測和區分豬瘟病毒(CSFV)，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環病毒2型(PCV-2)的方法，對76個仔豬樣本進行了檢測，檢出了3種病毒的存在，其中25個樣本32.9 %同時感染了2種以上病毒。結果表明寡核苷酸基因芯片檢測是一種快速、靈敏和高效的豬只混合感染病毒的病原學診斷方法。

2 疫苗研究進展

2.1 傳統疫苗

自1903年De Sehweinitz和Dorset首次證明CSFV是一種濾過性病毒以來，人們采用各種免疫方法預防和控制豬瘟。最初應用的是高免血清，但由于高免血清昂貴，獲取困難，加之血清有散毒的危險，因此高免血清的使用受到限制。后來出現許多滅活疫苗，其中福爾馬林和結晶紫滅活苗曾被廣泛應用。滅活疫苗雖然安全，但保存期短。所以人們開始研制弱毒活疫苗，其中應用較廣的是中國的兔化弱毒疫苗株，日本的細胞弱毒疫苗GPE-株，法國的Thiverval株，這些弱毒疫苗在豬瘟控制中起著重要作用。但是，使用弱毒活疫苗免疫的豬群，在流行病學調查和豬瘟防治工作中，不能用血清學方法來區分自然感染豬群和免疫接種豬群，另外，弱毒活苗還有可能與野毒重組或進行自然突變而造成毒力返強，出現免疫耐受現象。目前歐盟一些國家已禁止使用傳統疫苗，隨著對CSFV分子水平研究的不斷深人和分子生物學技術的不斷進步，基因工程亞單位疫苗和DNA疫苗成為研究的熱點。

2.2 基因工程亞單位疫苗

CSFV中具有免疫原性，能產生中和抗體的蛋白是E0和E2，糖蛋白E2是CSFV免疫原性最好的蛋白，基于E2的亞單位疫苗具有保護性并能產生高滴度的中和抗體。可以利用真核細胞高效表達系統來表達豬瘟病毒免疫原蛋白，并以此表達產物為抗原制造疫苗。桿狀病毒（Baculovirus）-昆蟲細胞系統可高水平表達外源蛋白，昆蟲細胞對蛋白質的加工和運轉過程與哺乳動物類似，所表達的蛋白“仿真”程度較高。Hulst等將豬瘟病毒E2基因cDNA重組入核型多角體病毒，并在sf21細胞中表達，用20～100 μg的表達蛋白免疫豬，可抵抗100 LD50的豬瘟強毒攻擊，其誘導產生的中和抗體水平遠高于由弱毒疫苗免疫產生的水平。目前由于該疫苗生產技術具有安全、穩定、可規模化等優點，同時又可根據流行毒株的變化，更換合適的E2 基因，因此，具有廣闊的應用前景。

2.3 病毒活載體疫苗

以無致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和偽狂犬病病毒（PRV）為載體，將豬瘟病毒E2基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動物后可對2種病毒產生良好的保護力。對此類疫苗的安全性和實用價值目前還有爭議，一旦將該病毒放入自然界中，將有可能衍變出對人、獸有危害的病毒變種。另一方面，偽狂犬病是較為普遍的一種疾病，豬瘟—偽狂犬病重組疫苗對于已感染或已免疫的動物不能產生保護力。Moormann等（1996）拼接出以C2株感染性全長cDNA，用強毒E2基因取代原有E2基因，構建出了豬瘟雜交病毒。Van Zijl等人將CSFV的E2蛋白基因重組到狂犬病病毒中，并進行高效表達，然后免疫豬，效果明顯。

2.4 標記疫苗

該疫苗就是對豬瘟兔化弱毒進行改造，使其缺失某一段基因或某一段特殊片段，但其免疫原性不改變。以缺失的基因所表達的蛋白作為診斷抗原，能夠區別疫苗接種豬和自然感染豬產生的抗體。便于及早發現感染動物，采取控制措施，可為在實施豬瘟“撲滅計劃”時減少大量錯殺導致的經濟損失。De Smit等人將C株進行重組克隆出了新的重組疫苗株。G R Risatti等研究了E2亞單位標記疫苗在實驗條件下的免疫保護情況并發現E2亞單位標記疫苗免疫效果明顯。

2.5 DNA疫苗

DNA 疫苗是近年發現并形成的一種新的疫苗研制技術，以配有原核復制元件和真核表達調控元件的質粒為載體，將豬瘟病毒主要保護性抗原基因插入該質粒中，使病毒核酸在動物機體內進行表達，從而刺激機體產生免疫保護。Hammmond等用表達CSFV E2基因的裸露質粒DNA免疫6周齡斷奶仔豬和7日齡提前斷奶乳豬，再將這2組豬群均用表達E2基因的腺病毒重組體（rPAV-gp55）加強免疫一次，用CSFV攻毒后，100%的仔豬和75%的乳豬獲得保護。但同時還應考慮核酸疫苗存在的安全性問題，Markowska Daniel等報道CSFV DNA 疫苗免疫豬后短時內體溫可高達40 ℃以上，對豬體有一定的影響。由于該重組子可通過發酵培養方式大量制備，又具有相對較好的穩定性，并且大容量的質粒還可同時容納多種病毒的免疫原基因，因此，這項制苗技術具有很大的研究價值。

3 防控中的幾項實用技術

3.1 確定疫苗含量、并能和野毒感染進行鑒別的實用技術

主要包括RT-PCR（套式PCR技術和熒光定量PCR技術），膠體金等。

我國采用免疫豬瘟兔化弱毒疫苗很好地預防和控制了豬瘟在我國的大規模流行，疫苗含量是保證疫苗有效的關鍵因素。RT-PCR（套式PCR技術和熒光定量PCR技術），膠體金等可以進行此類工作。可以使基層獸醫在疫情暴發時在現場確診，及早采取措施控制疾病的流行。根據CSFV野毒和弱毒核酸序列差異建立的套式PCR技術和熒光定量PCR技術，能區分CSFV野毒和弱毒，主要用于進行實驗室診斷，不適合現場檢測，臨床迫切需要一種能區分野毒和疫苗毒方法的出現，2006年出現了利用MGB探針建立了區分韓國5KLOM疫苗株和野毒株的方法；2008年國內有學者也建立了能區分HCLV疫苗株和野毒株的多重RT-PCR方法和FQ-PCR方法，前者由PCR后處理，易污染；后者雖不需后處理，但與前者一樣，分2步進行，費時。

膠體金免疫層析技術是20世紀90年代發展起來的一種新型體外診斷技術。該診斷方法快速簡便，操作簡單，無需儀器，結果準確。其基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細層析作用，使抗原抗體在固相膜上反應，然后用膠體金標記的抗體顯色，陽性反應在膜上呈現紅色，陰性反應則不出現紅色。已經報道的豬瘟膠體金診斷技術，主要基于豬瘟病毒抗體定量檢測和病原定性檢測，對豬感染CSFV野毒或接種免疫弱毒疫苗不能進行鑒別診斷。哈獸研利用了能區分CSFV野毒和兔化弱毒的單克隆抗體，結合膠體金免疫層析技術，研制了能鑒別診斷CSFV野毒和兔化弱毒的膠體金免疫層析試紙條。

3.2 鑒別豬瘟病毒、牛腹瀉病毒的實用技術

豬瘟病毒、牛腹瀉病毒是同一類的病毒，它們感染癥狀相似，而且牛腹瀉病毒引起的抗體會混淆、誤導豬瘟的免疫，并且這些年來我們國家有些廠家的疫苗并不合格，主要是含有牛腹瀉病毒。因此以牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）特異引物P1/P3擴增BVDV標準毒株及以豬瘟病毒（HCV）特異引物P2/P3擴增HCV陽性病料，分別擴增出326 bp和252 bp的特異片段；以P1、P2、P3擴增BVDV和HCV人工混合感染樣品，擴增出大小為326 bp和252 bp的2條片段，建立特異的一步檢測BVDV和HCV的復合PCR方法。以建立的復合PCR方法檢測BVDV分離株，都擴增出1條326 bp的特異片段；從送檢的病料和豬瘟兔化弱毒疫苗中擴增出252 bp的特異片段，從疑似豬瘟病豬的血清病料中，同時擴增出326 bp和252 bp的核酸片段，表明某豬場流行的“豬瘟”為BVDV和HCV混合感染。為進行HCV和BVDV的鑒別診斷與流行病學調查提供了有效的方法，特別是為鑒定合格的疫苗提供了技術手段。

3.3 快速確診豬瘟病毒以及簡單測定豬瘟抗體的的實用技術

可以使基層獸醫在疫情暴發時在現場確診，及早采取措施控制疾病的流行。如果能夠在免疫以后能夠隨時確定抗體，在平時可以進行抗體追蹤和隨時監測，那將是十分方便的。正如剛才介紹的，膠體金可以實現這2個愿望。

3.3.1 當母豬分娩時，用抗體免疫金標試紙條檢測母豬的抗體水平

如果在試紙條上只出現1條色帶（C質控帶），說明母豬體內的抗體滴度低于抵抗強毒攻擊的最低保護抗體滴度，母豬應當及時進行疫苗接種，同時乳豬應當及時采用超前免疫，以免發生PRRS病。如果試紙條上出現2條色帶，說明體內的抗體滴度較高，可以抵抗強毒的攻擊，就不需要進行超前免疫，因為母豬可以通過初乳把抗體垂直帶給仔豬。這時仔豬可以按照正常的免疫程序進行預防注射。

3.3.2 外購豬時，可用抗體免疫金標試紙條檢測其是否免疫或免疫是否有效

為了防止CSFV發生，選擇什么時間再進行CSFV免疫最合適，則可以根據不同地區，不同日齡的豬只，選擇有代表性的豬只采血，應用豬CSFV抗體免疫金標試紙條進行快速檢測，通過檢測結果，可以了解整個豬群PRRS抗體的狀況，從而決定是否及時開展免疫及選擇適宜的免疫劑量，這樣可以大大地避免PRRS的發生。

3.3.3 在懷疑發生CSFV時使用，可以采集病豬血液（血清）

用CSFV金標檢測試紙檢測，如果是發生CSFV時，豬體血液中沒有CSFV抗體或抗體滴度很低。當然，發生CSFV而耐過不死的豬只，抗體滴度可能會很高。

3.3.4 在發生CSFV后使用

當發生CSFV時，常規的處理程序是全面隔離消毒和緊急預防注射。此時豬群特別是種豬場的豬群抗體滴度差異很大，當緊急預防注射后，抗體滴度又會出現明顯的差異，因此，還應當了解豬群CSFV抗體水平，制定合理的免疫程序尤為重要。

4 問題與展望

迄今為止，人們對CSFV的研究始終沒有停止過，CSFV的結構蛋白已經定位，但對非結構蛋白的定位、功能等研究還較少。對本病診斷方法的研究，由于近幾年CSF的流行情況、臨床癥狀等都發生了一些新的變化，以慢性、隱性感染為主，因此需要建立一種敏感性好、特異性強、快速方便的檢測方法。許多的研究表明，該病毒與細小病毒和大腸桿菌病等同時發生混合感染在豬群中已經相當的普遍，要想根除本病，需要制定更為科學的防治方法。現在雖然很少發生CSF大流行，但在某些地區小范圍內還會經常發生，而且近幾年有上升的趨勢，給全球養豬業帶來了巨大的經濟損失。我國作為一個養豬大國，時刻不能放松對CSF的研究，特別是國內關于分子生物學和基因工程方面的研究，這不僅對養豬業是嚴峻的考驗，也給獸醫科技工作者提出了緊迫和重大的課題。