pNTAP－PRAK真核表達載體的構建及其在HEK293細胞中的表達*

王達安， 龔小衛， 劉愛華， 梅柱中， 王 丹， 明小燕， 王 旭，魏 潔， 鄧 鵬， 姜 勇△

(1南方醫科大學病理生理學教研室和廣東省蛋白質組學重點實驗室，3南方醫院呼吸科，廣東 廣州 510515;2暨南大學醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

p38調節活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase，PRAK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，人PRAK由471個氨基酸組成，分子量約54 kD，存在于人的多種組織及細胞中。早期有關PRAK功能的研究主要集中在介導p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38MAPK)通路的細胞應激反應過程［1，2］，近年發現PRAK可能還參與調節細胞增殖和細胞衰老過程［3，4］，并在細胞周期的有絲分裂調控中發揮重要作用［5］。然而，PRAK在介導各種生理和病理過程中的確切功能及其調控的分子機制仍未完全清楚;為此，我們構建了PRAK與串聯親和純化(tandem affinity purification，TAP)標簽融合表達的載體，并建立其在HEK293細胞中穩定表達的細胞系，為利用TAP系統進一步研究PRAK在細胞信號轉導過程的作用奠定基礎。

材料和方法

1 主要儀器

臺式微量離心機和臺式低溫高速離心機(Beckman);PCR儀(Biometra);Mini VE垂直電泳系統、水平電泳儀和半干電轉儀(Amersham Pharmacia Biotech);凝膠成像系統(Vilber Lourmat);CO2培養箱(Heraeus);熒光顯微鏡(Leica);IS2000R多功能影像系統(Kodak)。

2 主要試劑

DNA ladder、質粒小量制備試劑盒和凝膠回收試劑盒(Axygen);限制性內切酶BamHⅠ/HindⅢ、高保真DNA聚合酶Pyrobest和T4 DNA連接酶(TaKa-Ra);脂質體轉染試劑PolyFect 2000(Qiagen);無血清培養基Opti－MEM(Gibco－BRL);DMEM培養基和胎牛血清(HyClone);G418(Sigma);兔抗鈣調蛋白結合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)單克隆抗體(Millipore);辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology);Alexa Fluor 488偶聯的抗兔IgG(Molecular Probes);其它試劑均為國產分析純;引物合成由Invitrogen公司完成。

3 質粒、菌株和細胞株

串聯親和純化載體 pNTAP(stratagene);質粒pcDNA3.1－HA－PRAK、大腸桿菌菌株 DH5α和HEK293細胞系為本實驗室保存。

4 pNTAP－PRAK重組質粒的構建及鑒定

根據GenBank中的人PRAK編碼序列(序列號AF032437)設計PCR引物，其中在上游引物5'端引入BamHⅠ酶切位點，下游引物5'端引入HindⅢ酶切位點。上游引物5'－TAGGATCCTCGGAGGAGAGCGACATGGAC －3'，下游引物 5'－TCAAAGCTTTTATTGGGATTCGTGGGACGTG－3'。以 pcDNA3.1－HAPRAK質粒為模板，用高保真度DNA聚合酶Pyrobest進行PCR擴增帶酶切位點的目的片段PRAK，擴增片段的大小為1.4 kb。PCR反應參數為:94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1min，共35個循環。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后，用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，隨后用T4 DNA連接酶將其與BamHⅠ/HindⅢ雙酶切并電泳切膠回收的pNTAP進行16℃過夜連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，接種至含卡那霉素(Kan+)的LB瓊脂糖培養板上培養，挑取單菌落接種于LB培養基(Kan+)中，37℃振搖過夜。取菌液用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒，分別進行PCR及BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，并最終經DNA序列分析進行驗證。構建的重組質粒命名為pNTAP－PRAK。

5 基因轉染及穩定表達細胞系的篩選

將HEK293細胞接種至60 mm培養皿中，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培養至約70%融合度時，采用PolyFect使用說明書介紹的方法將pNTAP－PRAK質粒轉染至HEK293細胞，轉染48 h后，以4000 mg/L G418篩選30 d，獲得具有G418抗性的陽性細胞克隆，再用有限稀釋法作單細胞化克隆篩選，擴增培養后經Western blotting及細胞免疫熒光鑒定為陽性的細胞克隆即為穩定表達TAP tagged－PRAK的 HEK293細胞系，命名為HEK293－TAP tag－PRAK細胞;以未轉染的HEK293細胞作篩選的空白對照。

6 Western blotting免疫印跡分析法

收集G418篩選后的HEK293－TAP tag－PRAK細胞，裂解后取20 μL處理后的蛋白樣品進行SDSPAGE電泳(5%濃縮膠，恒壓80 V 30 min;12%分離膠，恒壓120 V 2 h)，電轉移至 PVDF膜上(恒流80 mA 1 h)，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉 3 h，與1∶8000稀釋后的Ⅰ抗(兔抗CBP抗體)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后與1∶6000稀釋后的Ⅱ抗(HRP標記的抗兔IgG)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光法檢測目的蛋白表達情況。以野生型HEK293細胞裂解樣品作陰性對照，瞬時轉染pNTAP－PRAK質粒的HEK293細胞裂解樣品為陽性對照。

7 細胞免疫熒光標記法

將HEK293－TAP tag－PRAK細胞接種至Petri皿，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培養24 h，去除培養液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗1次，用含0.1%Triton X－100的PBS(PBST)透化細胞膜5 min，PBS洗3次，0.1%硼氫化鈉處理細胞5 min，PBST洗1次，3%BSA封閉2 h，PBST洗1次，加入按1∶800稀釋的Ⅰ抗(兔抗CBP抗體)，4℃孵育過夜，PBST洗3次，加入按1∶500稀釋的Ⅱ抗(Alexa Fluor 488偶聯的抗兔IgG)，室溫孵育2 h，PBST洗3次，DAPI染核5 min后封片，用Leica熒光顯微鏡的L5和A4濾光片觀察上述重組載體在細胞中的表達和定位情況，并進行圖像采集;以野生型HEK293細胞作陰性對照。

結 果

1 PRAK片段的擴增

將利用pcDNA3.1－HA－PRAK作模板進行PCR擴增得到的PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見在約1.4 kb處有1條帶，見圖1，與預計的目的片段大小位置相符。

Figure 1.PRAK amplified by PCR.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product.圖1 PRAK的PCR擴增

2 重組質粒的鑒定

pNTAP－PRAK重組質粒PCR產物及BamHⅠ/HindⅢ雙酶切產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約1.4 kb和4.5 kb大小的片段，與預計大小相符，見圖2。DNA測序結果顯示與人的PRAK開放閱讀框序列一致。

Figure 2.Identification of recombinant plasmid pNTAP－PRAK.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product;Lane 3:product digested by restriction endonuclease.圖2 重組質粒pNTAP－PRAK的鑒定

3 Western blotting結果

檢測結果顯示瞬時轉染pNTAP－PRAK質粒的HEK293細胞樣品和HEK293－TAP tag－PRAK細胞系樣品對應泳道均可見在約62 kD(PRAK+TAP tag)處有明顯的免疫雜交條帶，但HEK293－TAP tag－PRAK細胞系的條帶明顯弱于瞬時轉染pNTAPPRAK質粒的 HEK293細胞，見圖 3;而野生型HEK293細胞樣品對應泳道未見陽性條帶。

Figure 3.Expression of fusion protein TAP tagged－PRAK in cells detected by Western blotting.Lane 1:HEK293 cells(wild type);Lane 2:HEK293 cells transientlytransfected with plasmid pNTAP－PRAK;Lane 3:HEK293－TAP tag－PRAK cell line.圖3 Western blotting檢測TAP tagged－PRAK的表達

4 細胞免疫熒光檢測結果

HEK293－TAP tag－PRAK細胞的免疫熒光檢測結果顯示TAP tag－PRAK融合蛋白在所有細胞中均有表達，且融合蛋白主要分布在細胞核中;而野生型HEK293細胞內未檢測到標記的蛋白綠色熒光信號，見圖4。

Figure 4.Expression and localization of fusion protein TAP tagged－PRAK in HEK293－TAP tag－PRAK cell line(immunofluorescence assay，×400).1:fusion protein TAP tagged－PRAK labelled with Alexa Fluor 488;2:nucleus stained with DAPI dye.圖4 TAP tagged－PRAK融合蛋白在HEK293－TAP tag－PRAK細胞系中的表達和定位

討 論

PRAK又稱MAPK激活的蛋白激酶5(MAPK－activated protein kinase 5，MAPKAPK5/MK5)，是1998年作為p38MAPK的下游底物被克隆和鑒定出來的，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶;人PRAK由471個氨基酸組成，分子量約54 kD;PRAK在人的心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎和胰腺等多種組織以及 HEK293、A549、HeLa、HepG2 和 Jurkat等細胞中均有表達［2］。在靜息狀態下，內源性PRAK主要分布于細胞質，而外源性PRAK則主要分布于細胞核內。實驗顯示，PRAK存在核－質穿梭功能;在受刺激時，PRAK入核減少，而出核增多，因而更多的PRAK分布在細胞質中［6］。PRAK是MAPK激活的蛋白激酶家族中相對較新的1個成員，相關研究報道不多;其激活途徑、激活方式、下游底物、介導的功能以及核－質移位與功能之間的關系等至今尚未完全清楚。

現有的PRAK激活途徑和功能研究報道主要集中在與p38MAPK和細胞外信號調節激酶(extracellular－signal regulated protein kinase，ERK)成員ERK3/4之間的相互關系方面。早期的研究報道顯示 PRAK 可受 p38MAPK 通路調控;研究發現［2，4］，細胞在應激和致炎細胞因子的刺激下，PRAK的Thr182能夠被p38MAPKα和p38MAPKβ磷酸化而激活，繼而磷酸化并激活熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，從而介導細胞骨架重構，參與細胞應激反應;而且p38MAPKα和p38MAPKβ引起的PRAK磷酸化還可導致PRAK的核－質移位［5］，但PRAK的移位與其介導的功能有何關系至今未見相關報道。有研究者認為癌基因ras的表達產物Ras能通過p38MAPK通路激活PRAK，而PRAK反過來負反饋地抑制Ras介導的細胞增殖［3］。另外，最近也有研究顯示，PRAK可能參與癌基因產物Ras誘導的細胞衰老過程，此過程也可能涉及p38MAPK通路;即Ras通過某種方式激活p38MAPK通路，后者引起PRAK的磷酸化、激活，激活的PRAK再磷酸化、激活p53，從而促進細胞衰老，此過程還與抑制細胞惡變有關［4］。但 Shi等［7］對 PRAK 受 p38MAPK 通路調控的觀點提供了質疑，他們的研究結果顯示，雖然過表達的p38MAPK能磷酸化PRAK，但生理表達水平的p38MAPK并不能顯著增加PRAK活性，而且生理表達水平的PRAK也不能有效地激活HSP27。因此，PRAK與p38MAPK通路的關系還需進一步驗證。另一研究較多的PRAK調控因素是ERK3/4;有研究顯示［8，9］，MAKP 通路中的非典型成員 ERK3和ERK4可直接磷酸化、激活PRAK，并引起PRAK核－質移位，推測PRAK可能參與ERK3和ERK4介導的胚胎發育的調控過程;但PRAK激活后通過何種底物發揮此作用至今尚不清楚。除了p38MAPK和ERK3/4可能參與PRAK的調控外，本實驗室最近的研究提示PRAK和雙泛素(diubiquitin)的相互作用也可能在細胞周期的有絲分裂調控中發揮重要作用;研究結果表明，PRAK可拮抗diubiquitin介導的細胞染色體不穩定和多形核的出現;但該研究未能得到PRAK和diubiquitin在細胞內結合的直接證據［5］;而且，是什么因素調節、介導它們的相互作用也有待進一步研究闡明。綜上所述，PRAK可能參與多種細胞功能的調控過程，但目前對PRAK的功能及其作用機制認識還非常有限，已有的研究結果也存在一些需要進一步驗證的地方;此外，PRAK是否還有其它未發現的激活調控途徑以及其它功能?這些問題都需要進一步探討。

TAP技術是1999年由Rigaut等［10］建立起來的一種用于研究蛋白質相互作用的新方法。TAP技術的核心是:應用分子克隆方法將所研究的蛋白質復合體中一已知蛋白質組分(誘餌蛋白)克隆到帶有2個不同的親和純化標簽的表達載體上，我們構建的TAP融合載體帶有鏈親和素結合多肽(streptavidin binding peptide，SBP)和鈣調蛋白結合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)2種親和純化標簽，在親和純化標簽與誘餌蛋白構成的融合蛋白表達后，經過連續二步的親和純化，在生理條件下將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白質以蛋白質復合體的形式純化出來，再利用生物質譜等下游技術對蛋白質復合體的組分進行鑒定，從而闡明蛋白質相互作用的分子機制。該蛋白質復合體純化策略既能保證目的蛋白的高效回收，又能保證目的蛋白的純度，TAP的應用使蛋白質相互作用的研究在方法學上獲得了重大進步。為進一步從蛋白質相互作用的角度探討PRAK的生物學功能，我們把PRAK克隆到N端的TAP載體上，并觀察其在 HEK293細胞中的表達情況。Western blotting結果顯示瞬時轉染pNTAP－PRAK質粒的HEK293細胞樣品和HEK293－TAP tag－PRAK細胞系樣品均可見分子量與PRAK+TAP tag大小相符的免疫雜交條帶，說明該重組質粒能在HEK293細胞中有效表達，且PRAK與TAP tag的融合并沒有影響兩者的表達，也沒有影響TAP tag中CBP的抗原性。此外，為減少因瞬時轉染時外源性基因高表達所引起的蛋白質非特異性相互作用對將來TAP鑒定結果的影響，我們利用融合載體上的新霉素抗性，對轉染pNTAP－PRAK重組質粒后的HEK293細胞進行了G418篩選，建立起穩定表達的細胞系;Western blotting鑒定結果顯示HEK293－TAP tag－PRAK細胞系的條帶明顯弱于瞬時轉染pNTAP－PRAK質粒的HEK293細胞，表明HEK293－TAP tag－PRAK細胞系能低水平穩定表達TAP tagged－PRAK，有效避免了外源性基因的過高表達。細胞免疫熒光結果顯示融合蛋白主要分布在細胞核內，這與既往有關外源性PRAK的細胞定位研究結果一致［6］，說明 PRAK與 TAP tag的融合并沒有影響到外源性PRAK的細胞定位。以上工作為利用TAP系統進一步深入研究PRAK的生物學功能奠定了基礎。

［1］姜 勇，羅深秋.細胞信號轉導的分子基礎與功能調控［M］.第1版.北京:科學出版社，2005.141.

［2］New L，Jiang Y，Zhao M，et al.PRAK，a novel protein kinase regulated by the p38 MAP kinase［J］.EMBO J，1998，l17(12):3372 －3384.

［3］Chen G，Hitomi M，Han J，et al.The p38 pathway provides negative feedback for Ras proliferative signaling［J］.J Biol Chem，2000，275(50):38973 －38980.

［4］Sun P，Yoshizuka N，New L，et al.PRAK is essential for ras－ induced senescence and tumor suppression［J］.Cell，2007，128(2):295 －308.

［5］劉亞偉，劉靖華，謝汝佳，等.人FAT10蛋白過表達誘導饑餓狀態下HEK293細胞發生凋亡［J］.中國病理生理雜志，2007，23(10):1937 －1941.

［6］New L，Jiang Y，Han J.Regulation of PRAK subcellular location by p38 MAP kinases［J］.Mol Biol Cell，2003，14(6):2603－2616.

［7］Shi Y，Kotlyarov A，Laaβ K，et al.Elimination of protein kinase MK5/PRAK activity by targeted homologous recombination［J］.Mol Cell Biol，2003，23(21):7732 －7741.

［8］Seternes O，Mikalsen T，Johansen B，et al.Activation of MK5/PRAK by the atypical MAP kinase ERK3 defines a novel signal transduction pathway［J］.EMBO J，2004，23(24):4780－4791.

［9］Aberg E，Perander M，Johansen B，et al.Regulation of MAP－activated protein kinase 5 activity and subcellular localization by the atypical MAPK ERK4/MAPK4［J］.J Biol Chem，2006，281(46):35499 －35510.

［10］Rigaut G，Shevchenko A，Rutz B，et al.A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration［J］.Nat Biotechnol，1999，17(10):1030－1032.