不同劑量乙醇對小鼠早期肝纖維化的影響及機制研究*

賈 青， 張維東， 王朝霞， 王兆朋， 張月英， 張俊平

(山東省醫學科學院基礎醫學研究所實驗病理研究室，山東 濟南 250062)

長期大量飲酒可造成脂肪肝、肝功能損害，并最終形成肝硬化，給人們的健康帶來很大的危害，因此越來越受到人們的關注。目前認為乙醇誘導形成肝纖維化存在多種機制，肝組織中星形細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化是肝纖維化形成的中心環節，標志之一是 α－平滑肌肌動蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)在 HSCs細胞中的過度表達［1－3］。關于過量飲酒與長期少量飲酒導致肝纖維化機制的異同，相關文獻很少。據Carson等［4］研究報道，大鼠在每日攝入乙醇(3－4)g·kg－1時行為無異常，(6－7)g·kg－1時出現嚴重的共濟失調，這一劑量區間含蓋了酗酒人群典型的行為表現。本實驗采用3 g·kg－1和8 g·kg－12種劑量乙醇誘導形成早期肝纖維組織增生，通過檢測Toll樣受體4(Toll like receptor－4，TLR－4)、α －SMA 轉化生長因子 β(transforming growth factor－β，TGF－β)、核因子 －κB(nuclear factor－kappa B，NF－κB)蛋白表達、骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BMP and activin membrane－bound inhibitor，Bambi)mRNA 表達及細胞凋亡指數的變化，探討不同通路在不同劑量乙醇誘導肝纖維化過程中的作用及相互關系。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性昆明種小鼠24只，3周齡，體重18－22 g，購自山東大學實驗動物中心。隨機分為正常對照組、高劑量乙醇組、低劑量乙醇組，每組8只。喂養條件:室溫 (24±3)℃，濕度30% －45%。所用飼料:康大實驗動物標準飼料，許可證號為魯飼準證字364號。

1.2 藥物及試劑 無水乙醇(分析純級)天津市永大化學試劑開發中心生產，批號20050802，許可證號為XK13－201－00144，蒸餾水稀釋;TLR－4、α－SMA、TGF－β、NF－κB蛋白檢測所用Ⅰ抗為兔抗小鼠多克隆抗體，購自Biolegend;Ⅱ抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;TUNEL原位凋亡檢測試劑盒為羅氏公司產品;超敏化學發光試劑盒(BeyoECL Plus)購自碧云天生物技術研究所;總RNA提取試劑盒為Invitrogen Trizol reagent;實時定量PCR試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ及反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit均為大連寶生物工程有限公司產品。

1.3 主要實驗儀器 酶標儀:Bio－Rad Model 680;病理切片機:Leica RM2235;低溫高速離心機:Beckman AllegraTM64R Centrifuge;光學顯微鏡:Leica DM4000B;定量PCR儀:ABI 7500型熒光實時定量PCR儀。

2 方法

2.1 乙醇誘導早期肝纖維化模型的建立 參考Carson等［4］和李舒丹等［5］方法。小鼠適應性喂養3 d 后，高劑量乙醇組給予乙醇(5g·kg－1·d－1)，并在1周內逐漸增大至8 g·kg－1·d－1，低劑量乙醇組給予乙醇劑量為3 g·kg－1·d－1，正常對照組給予等量生理鹽水溶液，均為經口灌胃，自由進食進水。每周稱重2次，各組小鼠按乙醇灌胃量達到預定劑量后30 d處死，死亡小鼠隨時補充。摘除眼球取血約1 mL，快速取肝組織，冰浴生理鹽水輕輕沖洗后，部分肝組織放入10%甲醛固定液中，另取一部分肝組織快速放入－80℃低溫保存。肝組織固定24 h后，常規石蠟包埋，4 μm切片，備組織病理學觀察。

2.2 常規HE染色 光鏡下病理組織學觀察，參照2000年修訂的病毒性肝炎防治方案［6］，對炎癥及纖維化程度進行分級和分期。

2.3 常規Masson染色 膠原纖維組織標記為綠色，每張切片隨機選取10個200倍視野，Leica QwinV3圖像分析系統計算每個視野膠原纖維面積。

2.4 采用免疫組織化學法檢測TLR－4、α－SMA蛋白表達 Ⅰ抗稀釋濃度1∶100，微波熱抗原修復。肝組織脫水、石蠟包埋、4 μm切片、脫蠟、至水、抗原修復、羊血清封閉抗原、滴加Ⅰ抗、4℃孵育過夜、HRP偶聯羊抗兔IgG、37℃孵育1 h、鏡下二氨基聯苯胺(DAB)控制顯色、細胞核復染、脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片選取10個高倍視野，Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算著色區域積分吸光度值。

2.5 TUNEL原位凋亡檢測 嚴格按照TUNEL試劑盒使用說明操作，陽性結果判定標準為細胞核為黃褐色著色。每張切片隨機選取10個400倍視野計算凋亡細胞個數。

2.6 Western blotting檢測TGF、NF－кB 蛋白表達Ⅰ抗稀釋濃度1∶500。組織勻漿提取總蛋白，考馬斯亮藍法(Bradford)檢測蛋白濃度;十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)凝膠電泳;200 mA，轉膜1 h;5%封閉液封閉1 h;Ⅰ抗4℃過夜;Ⅱ抗室溫孵育1 h;TBS液清洗;ECL化學發光，暗室X光片顯影、定影;將X光片掃描，并用Image－Pro Plus 6.0軟件計算各條帶的積分吸光度值(IA)。

2.7 實時定量PCR檢測Bambi mRNA含量 Bambi上游引物序列為5'－GGGCACTAATCAGATACCCT－3'，下游引物序列為 5'－AAAGTGACCTGAAATTCGCAAA－3'。內參照 β－actin的上游引物為5'－GCACCACACCTTCTACAATGAG－3'，下游引物為5'－CAGAGGCATACAGGGACAGC －3'，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。抽提組織總RNA，按照Trizol試劑盒說明操作;反轉錄形成cDNA，按試劑說明配制10 μL逆轉錄體系，37 ℃15 min，85 ℃5 s;實時熒光定量PCR，按照試劑盒說明配制20 μL PCR反應體系，反應條件為:預變性95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。Ct值表示目標擴增產物達到設定閾值經歷的循環數。參考文獻［7］計算△Ct=Ct(Bambi)－Ct(β－actin)，△△Ct=［Ct(Bambi)－Ct(β －actin)］乙醇處理組－［Ct(Bambi)－Ct(β －actin)］正常對照組，采用相對定量法計算各組2－△△Ct。

3 統計學處理

結 果

1 肝組織形態學檢測結果

對照組肝細胞呈多角形，排列規整，大小正常，細胞核1－2個居中排列。大劑量乙醇組，肝細胞體積縮小，胞質內可見大量小的空泡狀結構，肝竇間隙增大，匯管區靜脈充血明顯，膽小管管腔狹窄，部分區域可見炎性壞死灶，Masson染色可見膠原組織增生明顯;小劑量乙醇組，肝細胞氣球樣變性，細胞體積明顯增大，竇間隙消失，偶見灶性壞死，Masson染色顯示膠原組織增生，見圖1、2。乙醇誘導組炎癥活動度及纖維化程度均高于對照組(P＜0.05)，見表1。

Figure 1.The hematoxylin－feosin staining showed the hepatic cells presented ballooning degeneration in low dose group(B)，but in high dose of alcohol group(C)the hepatic cells became diminution and the hepatic sinusoid expanded and were full of erythrocytes(×200).A:control;B:low dose of alcohol(3 g·kg－1·d－1);C:high dose of alcohol(8 g·kg－1·d－1).圖1 蘇木素－伊紅染色

Figure 2.Masson staining showed the areas of collagen fibers increased in the mice treated with alcohol and those of mice treated with alcohol at a high dose were more obviously(×200).A:control;B:low dose of alcohol;C:high dose of alcohol.圖2 Masson染色顯示乙醇誘導組肝膠原纖維增生，高劑量組增生更為明顯

表1 炎癥分級及纖維化分期結果Table 1.The inflammation grade and fibration staging(n=8)

2 膠原纖維面積檢測結果

乙醇誘導組膠原纖維面積與對照組比較差異顯著(P＜0.01)，高劑量組膠原纖維面積增生最為顯著，見表2。

表2 Masson染色膠原纖維面積計算結果Table 2.The collagen fiber areas were quantified based on 10 magnification fields(×200)per liver Masson－staining section by the software of Leica QWinV3(.n=8)

表2 Masson染色膠原纖維面積計算結果Table 2.The collagen fiber areas were quantified based on 10 magnification fields(×200)per liver Masson－staining section by the software of Leica QWinV3(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Areas of collagen fibre per visual field(μm2)Control 1126.21 ±393.34 Low dose of alcohol 7551.05 ±1708.80＊＊High dose of alcohol 11751.90 ±2167.20＊＊

3 免疫組織化學檢測結果

TLR－4蛋白在小劑量組較對照組表達明顯增多，在高劑量組表達減少;α－SMA蛋白在正常組只表達于血管平滑肌中，其它部位未見表達，乙醇誘導組除血管壁外，竇隙中星形細胞也表達SMA蛋白，且高劑量組表達更為明顯，見圖3。各組積分吸光度值見表3。

表3 各組TLR－4、α－SMA積分吸光度值比較Table 3.The comparison of integral absorbance of TLR －4 and α－SMA among groups(.n=8)

表3 各組TLR－4、α－SMA積分吸光度值比較Table 3.The comparison of integral absorbance of TLR －4 and α－SMA among groups(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 945868.00 ±13931.78 328.91 ±26.95 Low dose of alcohol 1492518.30 ±52925.59＊＊ 84547.01 ±1003.33＊＊High dose of alcohol 403218.91 ±6766.95＊＊ 194410.47 ±2169.26＊＊

Figure 3.Expression of TLR －4 and α －SMA in the liver with immunohistochemistry.TLR －4 is up－regulated in low dose group but decreases in high dose group(×200);α－SMA increases in alcohol－treated groups，but it increases more obviously in high dose group(×400).圖3 免疫組織化學法檢測TLR－4、α－SMA蛋白表達

4 Western blotting檢測結果

TGF－β、NF－κB蛋白含量在高劑量乙醇誘導組中升高最為顯著，在低劑量組中也明顯升高，見圖4。各組條帶積分吸光度值與內參照蛋白積分吸光度值比值見圖5。

Figure 4.Determination of TGF－β，NF－κB and β －actin protein expression in liver tissue by Western blotting.圖4 免疫印跡法檢測各組TGF－β、NF－кB及β－actin在肝組織中的表達

表4 各組凋亡細胞數比較Table 4.The apoptotic nuclei number in liver of mice in each group(.n=8)

表4 各組凋亡細胞數比較Table 4.The apoptotic nuclei number in liver of mice in each group(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group.

Control 0.67 ±0.14 Low dose of alcohol 4.83 ±0.71＊＊High dose of alcohol 9.26 ±1.03＊＊

Figure 5.Relative protein expression was quantified by the band absorbance against β－actin..n=8.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 蛋白條帶與β－actin積分吸光度比值

5 原位凋亡檢測結果

乙醇誘導組凋亡細胞數較正常對照組明顯增多，其中高劑量乙醇組細胞凋亡數最高，見圖6、表4。

表5 各組Bambi mRNA相對含量比較Table 5.Bambi mRNA relative content in each group(.n=8)

表5 各組Bambi mRNA相對含量比較Table 5.Bambi mRNA relative content in each group(.n=8)

*P ＜0.05 vs low dose group.

Group Ct(Bambi) Ct(β－actin) 2－△△Ct Control 34.5342±2.1210 28.9209±0.2579 Low dose of alcohol 32.3696±1.1682 28.8062±0.2012 4.1408±0.5314 High dose of alcohol 33.6458±1.5279 28.8312±0.1815 1.7400±0.4082*

Figure 6.Effects of different doses of alcohol on cell apoptosis in liver.Apoptotic nuclei in the liver was measured by the terminal deoxyribonucleotidy1 transferase－mediated dUTP nick－end labeling(TUNEL，×400).A:control;B:low dose of alcohol;C:high dose of alcohol.圖6 TUNEL檢測乙醇對各組肝組織細胞凋亡的影響

6 實時熒光定量PCR檢測結果

低劑量乙醇組Bambi mRNA的含量約為正常對照組的4.14倍，高劑量乙醇組Bambi mRNA含量較低劑量組顯著降低，見表4。

討 論

肝纖維化是長期大量飲酒造成肝硬化的必然病理過程，酗酒者顯然較長期少量飲酒者形成肝纖維化的危險性更高，但二者機制上是否存在差異目前研究不多。近年來TLR－4通路在肝纖維化中的研究越來越深入［8］，自從1997年Medzhitow首先報道人類TLR以來，這一家族目前共有11個成員，TLR－4是第1個被發現的人類TLR，主要功能為介導病原體細胞表面內毒素/脂多糖(LPS)的識別和信號轉導，在肝內主要存在于庫普弗細胞(Kupffer cells，KCs)及HSCs表面。肝臟為腸源性內毒素主要靶器官，酒精性肝硬化患者血液中LPS濃度顯著增高［9］，LPS結合LPS結合蛋白 (LPS－binding protein，LBP)后在CD14幫助下，通過TLR－4與髓樣細胞分化蛋白2(myeloid differentiaton protein－2，MD－2)形成的復合體，啟動下游信號轉導通路，最終激活NF－κB，通過調控下游基因轉錄，產生大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、氧自由基、TGF－β等活性分子，直接或間接激活HSCs，導致肝纖維化的形成。TGF－β是調控肝星形細胞活化的重要細胞因子［10］，它不僅能夠誘導靜止型的HSCs轉變為具有增殖性和成纖維性的肌成纖維樣細胞(myofibroblast，MFB)［11］，刺激細胞外基質(extracellular matrix，EMC)表達，通過調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及上調MMP組織抑制因子(issue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)降低 EMC 的降解［12，13］，促進肝纖維化的產生，而且能夠誘導細胞的凋亡［14］。體外實驗表明巨噬細胞吞噬凋亡細胞后促進了TGF－β的轉錄翻譯［15］，提示凋亡與纖維組織增生也有著密切關系。2007年Seki等［16］研究發現TLR－4是通過下調TGF－β偽受體Bambi增強了HSCs對TGF－β的敏感性，促進肝纖維化的發生，其中NF－κB抑制劑IκBsr完全抑制了LPS誘導的Bambi的下調，減少了TGF－β介導的膠原纖維的生成，說明NF－κB在肝纖維化中具有十分重要的作用。

本實驗對不同劑量乙醇誘導的小鼠分別檢測了TLR－4、TGF－β、α－SMA、NF－κB蛋白含量的變化，以及凋亡細胞數量的變化。結果顯示2種劑量乙醇均誘導肝內膠原纖維明顯增生，高劑量組(8 g·kg－1·d－1)增生更加顯著;另外大劑量組TGF－β、α－SMA、NF－κB蛋白較小劑量組含量更高，而高劑量組中TLR－4在KCs中的表達受到抑制，在低劑量組(3 g·kg－1·d－1)表達明顯升高。對各組凋亡細胞的檢測發現，2組乙醇誘導小鼠肝組織細胞凋亡率明顯升高，高劑量組細胞凋亡數明顯高于低劑量組。

以上實驗結果說明雖然TLR－4通路及凋亡機制在肝纖維化過程中都占據著重要位置，但酗酒造成肝組織內更多的細胞凋亡是纖維化程度更為嚴重的直接因素，酗酒小鼠肝組織內TLR－4蛋白表達及Bambi mRNA含量下調說明Bambi通路存在不依賴于TLR－4的另外的調控機制，這一機制是否與凋亡有關，則還需做進一步的實驗研究。

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