后處理對腸缺血－再灌注大鼠肺組織凋亡相關基因表達的影響*

褚薇薇， 聶 蕾， 和新盈， 閆愛麗， 周 伊， 吳庚利， 張潤岐

(西安醫學院基礎部病理教研室，陜西 西安 710021)

肺是腸缺血－再灌注損傷最常見的受損靶器官之一［1］。常見于腹腔動脈、腸系膜上動脈、門靜脈阻斷后恢復血流過程引起的急性肺損傷。急性肺損傷是臨床一種常見的危重病，死亡率高。因此，研究腸缺血－再灌注致急性肺損傷的發生機制和尋找相應的防治措施具有十分重要的臨床意義。

缺血后處理是近年發現的一種新的外科機械性干預措施，即再灌注前給予反復短暫的再灌注/停灌注的方法［2］。目前，缺血后處理已經成為缺血－再灌注損傷研究領域中的熱點，但大多集中在缺血－再灌注損傷的心肌和肝臟方面，對腸缺血－再灌注致急性肺損傷的作用及其機制的研究國內外少見報道［3］。課題組前期工作已經探討了后處理抗大鼠腸缺血－再灌注損傷的作用及其機制［4］。本研究通過觀測后處理對腸缺血－再灌注大鼠肺組織凋亡相關基因的影響，進一步深入研究其對腸缺血－再灌注致肺損傷的作用及其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 第1條鏈合成試劑盒購自Fermentas。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。凋亡調控蛋白 B cell lymphoma/leukemia－2(Bcl－2)、Bcl－2 associated X(Bax)和 caspase－3 mAb由Santa Cruz提供。辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗β－actin mAb由北京博奧森生物技術有限公司提供。

1.2 動物 健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，24只，體重230－280 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，術前禁食12 h，不禁水。

2 方法

2.1 動物模型復制 腹腔注射200 g/L烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉后，仰臥固定于操作板上，消毒后取腹正中切口長約3 cm進腹，用溫鹽水紗布將腸管推向左側腹腔，暴露右腎內上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，在其根部用無創傷血管夾夾閉阻斷SMA血運45 min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注6 h后經頸動脈放血處死。

2.2 實驗動物分組及處理 動物隨機分為3組(n=8):(1)假手術(sham)組:僅行開腹，分離SMA不夾閉;(2)缺血－再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)組:方法見模型復制;(3)缺血后處理(ischemic postconditioning，IPOST)組:缺血45 min后即刻行3個循環(灌注30 s后阻斷30 s)，余同I/R組。于再灌注6 h后，各組大鼠處死取材。

2.3 大鼠肺組織形態學觀察 左肺下部用10%中性甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察肺組織形態結構變化。

2.4 肺組織濕/干比值檢測 各組大鼠處死后，開胸取雙肺，濾紙吸干肺表面水分和血跡后稱重，置85℃ 烘箱內，干燥24 h至恒重，再稱重，計算肺組織濕重與干重比值(lung wet/dry weight ratio，W/D)，表示肺水腫形成情況。

2.5 大鼠肺組織 Bcl－2、Bax和 caspase－3 mRNA表達的檢測 采用RT－PCR方法，嚴格按照試劑盒說明書操作。提取肺組織總RNA，逆轉錄合成cDNA第1鏈，PCR擴增 Bcl－2、Bax和 caspase－3。Bcl－2引物上游5'－CTGGTGGACAACATCGCTCTG －3'，下游5'－ GGTCTGCTGACCTCACTTGTG － 3'，產物長度為228 bp。Bax引物上游5'－TCCAGGATCGAGCAGA－3'，下游5'－AAGTAGAAGAGGGCAACC －3'，產物長度為256 bp。Caspase－3引物上游 5'－GGAGCTGGACTGTGGCATTGA －3'，下游 5'－ CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA－3'產物長度為232 bp。β－actin引物上游5'－ATTGTAACCAACTGGGACG －3'，下游 5'－TTGCCGATAGTGATGACCT －3'，產物長度為 533 bp。采用終體積為25 μL的反應體系，94℃ 1 min，55℃1 min，72 ℃ 1 min，擴增 35個循環，72 ℃ 10 min。10 μL的PCR產物加入凝膠加樣孔中，80 V電壓行電泳40 min后紫外光下觀察和記錄結果并照相保存。在Gel Doc(Bio－Rad)凝膠成像分析系統上掃描定量。以β－actin為內參照，根據各條帶的A值分析Bcl－2、Bax mRNA表達水平。

2.6 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達的檢測 肺組織蛋白提取后，BCA法測定蛋白含量，按每泳道加總蛋白50 μg進行SDS－PAGE凝膠電泳，濕轉至硝酸纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗大鼠Bcl－2、Bax和caspase－3(1∶1000)Ⅰ抗，4℃孵育過夜，吐溫20－磷酸鹽緩沖液洗膜4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶6000)，增強化學發光系統(enhanced chemiluminescene，ECL)顯色20 min，X 光片曝光。β－actin作為內參照，對上樣一致性進行評估。采用GDS－8000型凝膠成像分析系統進行半定量分析。

3 統計學處理

應用SPSS 12.0統計軟件包進行分析和檢驗，組間比較采用方差分析，當P＜0.05時，進一步作均數的兩兩比較用q檢驗。結果用均數±標準差()表示。

結 果

1 大鼠肺組織病理學變化

假手術組大鼠肺組織未見明顯形態學異常，肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見水腫液及血液淤滯;缺血－再灌注組大鼠可見肺泡間隔明顯增寬、毛細血管擴張充血、大量炎癥細胞浸潤等;缺血后處理組以上病理改變均較缺血－再灌注組有不同程度緩解，見圖1。

2 肺組織濕/干比值

與假手術組相比，缺血－再灌注組肺組織W/D明顯增加(P＜0.05)，而缺血后處理組肺組織W/D則顯著低于缺血－再灌注組(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Histopathological changes of rat lungs 6 h after intestine ischemia/reperfusion(I/R)injury(HE staining，×100).A:sham group;B:I/R group;C:ischemic postconditioning group.圖1 大鼠肺組織病理變化

3 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA表達的變化

假手術組大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達相對較低或不表達;缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2 mRNA表達下調，Bax和caspase－3 mRNA表達明顯上調(P＜0.05);而缺血后處理組Bcl－2 mRNA表達水平明顯高于缺血－再灌注組(P＜0.05);Bax和caspase－3 mRNA表達量則明顯低于缺血－再灌注組(P＜0.05)，見圖3、4。

Figure 2.Lung W/D ratio of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.I/R:intestine ischemia/reperfusion.IPOST:ischemic postconditioning.圖2 各組大鼠肺組織W/D變化

Figure 3.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion.Lane 1:sham group;Lane 2:intestine I/R group;Lane 3:IPOST group;M:DNA marker(100 bp).圖3 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達

Figure 4.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.圖4 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達

4 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達的變化

假手術組大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達相對較低或不表達;缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2蛋白表達水平下降，Bax和caspase－3蛋白表達明顯增加(P＜0.05);而缺血后處理組Bcl－2蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05);Bax和caspase－3蛋白表達量則明顯降低(P＜0.05)，見圖5、6。

Figure 6.Comparison of the protein expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs I/R group.圖6 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達

討 論

缺血－再灌注損傷能造成遠隔器官受損，即非缺血區域組織器官功能的損傷。腸缺血－再灌注損傷不僅可以引起腸道局部的組織損害和腸道機械屏障功能受損，而且可以導致腸源性細菌和內毒素移位進入體循環造成全身擴散。肺是腸缺血－再灌注損傷最常見的受損靶器官之一［1］。本研究發現，缺血－再灌注組大鼠出現肺泡壁增寬、大量炎癥細胞浸潤、毛細血管擴張、血液淤滯等病理變化。

腸缺血－再灌注損傷誘發體內細胞因子和炎癥介質的激活，進而啟動嗜中性白細胞在肺內聚集并釋放氧自由基引起細胞凋亡是導致急性肺損傷的中心環節。細胞凋亡是一種受基因調控的主動性細胞死亡，表現為凋亡信號通路的啟動及相關基因的表達。其中Bcl－2家族成員是細胞凋亡過程中的一類重要抑凋亡基因;另一類是促凋亡基因如Bax等。細胞凋亡的發生很大程度上取決于促凋亡成員和抑凋亡成員的相對濃度［5－7］。Bcl－2 和 Bax分別是典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Bcl－2蛋白主要分布于核膜、內質網膜和線粒體膜上。Bax正常情況主要位于細胞質中，在凋亡信號誘導后很快遷移到線粒體，2個Bax蛋白相互聚合形成同二聚體，作為細胞色素C通過線粒體膜進入胞質的通道，促進細胞凋亡。由此看出，Bcl－2/Bax兩蛋白之間比例是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素。本實驗研究結果發現，腸缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2 mRNA和蛋白表達水平下降，而Bax mRNA和蛋白表達水平則明顯升高，提示大鼠腸缺血－再灌注損傷致肺組織細胞凋亡的發生與凋亡調控基因Bcl－2和Bax的表達異常有關。

Vinten－Johansen等［8］發現，缺血后處理可減少再灌注損傷特別是心肌梗死、細胞凋亡。Dosenko等［9］證明缺氧后處理不僅能減少心肌再灌注時細胞的壞死也能減少細胞凋亡。本研究采用3個循環的30s灌注后30s阻斷的缺血后處理，大鼠肺組織病理形態學變化緩解，水腫程度減輕，提示后處理具有抗腸缺血－再灌注致肺損傷的作用。本實驗結果還顯示，缺血后處理可使Bcl－2 mRNA表達和蛋白表達水平升高，Bax mRNA和蛋白表達降低。提示后處理可通過上調Bcl－2 mRNA和蛋白的表達，下調Bax mRNA和蛋白表達，從而減輕腸缺血－再灌注致肺損傷的作用。為了進一步證明缺血后處理的這種保護作用，本研究還檢測了caspase－3的表達，結果顯示，缺血后處理組大鼠肺組織中caspase－3 mRNA和蛋白的表達明顯低于缺血－再灌注組，表明后處理可通過抑制caspase－3的活化減少肺組織細胞凋亡。

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